慶大霉素作用下耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的可塑性研究.pdf

1、背景和目的： 隨著生活水平的提高，人們對(duì)健康的要求有了和以往不同的內(nèi)容，除了生存時(shí)間，還期待更高的生活質(zhì)量。在這種現(xiàn)狀下，聽(tīng)力損失對(duì)人類健康的威脅得到了高度重視。藥物、衰老是引起聽(tīng)力損失的主要原因。在我國(guó)，氨基糖甙類藥物導(dǎo)致的聽(tīng)力損失位居各種致聾因素之首，作為引起感音神經(jīng)性聾的主要原因，學(xué)者們從形態(tài)、蛋白質(zhì)表達(dá)、基因調(diào)控、電生理記錄等各個(gè)方面對(duì)其耳毒性機(jī)理進(jìn)行了大量研究，但研究主要集中在耳蝸的內(nèi)、外毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)元部位

2、。內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸(ribbon synapse)，是將聲音信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一個(gè)傳入神經(jīng)突觸，它在氨基糖甙類藥物引起的聽(tīng)力損失過(guò)程中發(fā)揮的作用并沒(méi)有得到關(guān)注。 耳蝸?zhàn)鳛椴溉閯?dòng)物的聽(tīng)覺(jué)器官，能夠編碼不同頻率和強(qiáng)度的聲音。耳蝸的外毛細(xì)胞對(duì)聲音頻率的有高度敏感性和選擇性，對(duì)聲音有放大作用；內(nèi)毛細(xì)胞是負(fù)責(zé)將聲音信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感受細(xì)胞。內(nèi)毛細(xì)胞將聲波的振動(dòng)模擬為電信號(hào)，在內(nèi)毛細(xì)胞形成電勢(shì)差，從而刺激神經(jīng)遞質(zhì)由內(nèi)毛細(xì)胞帶

3、狀突觸釋放到相應(yīng)的螺旋神經(jīng)元，再由螺旋神經(jīng)元投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。聽(tīng)力損傷常常認(rèn)為與內(nèi)、外毛細(xì)胞的損傷和/或螺旋神經(jīng)元細(xì)胞的變性相關(guān)。連接螺旋神經(jīng)元和內(nèi)毛細(xì)胞的帶狀突觸作為內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元細(xì)胞之間的紐帶，是影響聲音信號(hào)傳遞的重要原因，卻一直沒(méi)有得到充份重視。 大量的研究證實(shí)，突觸傳遞的效能不是固定不變的。在突觸前神經(jīng)元興奮，通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起突觸后電位的變化，從而完成電信號(hào)的傳遞過(guò)程中，突觸本身的功能和形態(tài)都可能發(fā)生改變

4、。這種變化既可以是突觸傳遞效能的增強(qiáng)，也可以是突觸傳遞效能的減弱；既可以是短時(shí)程的(數(shù)秒到數(shù)分鐘)；也可以是長(zhǎng)時(shí)程的(數(shù)小時(shí)到數(shù)周)。突觸傳遞效能的各種變化統(tǒng)稱為突觸可塑性。由于聲音信息通過(guò)聽(tīng)神經(jīng)的動(dòng)作電位傳遞入腦，所以帶狀突觸結(jié)構(gòu)的重新排列和/或變性會(huì)對(duì)聲音編碼產(chǎn)生重要的影響。在耳蝸的某一位置內(nèi)毛細(xì)胞和傳入神經(jīng)之間信號(hào)傳遞的破壞會(huì)影響這一位置所對(duì)應(yīng)的語(yǔ)言信號(hào)的理解?；谏鲜隹紤]，在藥物性耳聾的小鼠中，內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的形態(tài)和功能都將發(fā)

5、生改變。 由于內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸所在的位置深在、數(shù)量極少，一直以來(lái)，對(duì)它的研究進(jìn)展緩慢，在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。近年來(lái)隨著研究技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)展，國(guó)外的研究者對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸正常生理?xiàng)l件下的形態(tài)、分子解剖、電生理等方面的研究取得了一定進(jìn)展，使我們得以對(duì)病理狀態(tài)下的內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。 通過(guò)電子顯微鏡觀察，典型的耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的帶狀突觸為球形或橢球形的電子密度體。周圍附著單層突觸

6、囊泡。隨著聽(tīng)力水平的不同，帶狀突觸的數(shù)量和形態(tài)也出現(xiàn)變化。例如，小鼠的每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞有16.8±2.4個(gè)帶狀突觸，而在聽(tīng)閾增加之后，帶狀突觸的數(shù)量減少并且體積增大。對(duì)毛細(xì)胞電鏡超薄連續(xù)切片的重構(gòu)可以得出帶狀突觸的準(zhǔn)確數(shù)量。這些對(duì)動(dòng)物正常生理情況下內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸形態(tài)的研究方法和研究結(jié)果為病理?xiàng)l件下的進(jìn)一步研究打下了良好的基礎(chǔ)。 本研究使用慶大霉素腹腔注射制作小鼠感音神經(jīng)性聾模型，研究感音神經(jīng)性聾發(fā)展過(guò)程早期的內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸可塑性

7、變化：分別對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的數(shù)量和功能加以研究。使用免疫熒光雙標(biāo)對(duì)突觸前結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)IBEYE及突觸后膜受體蛋白GluR2—3進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡、3d max8.0軟件三維重建對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸進(jìn)行數(shù)量分析。使用免疫熒光標(biāo)記及Western blotting對(duì)otoferlin蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析，由于otoferlin在內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。對(duì)otoferlin蛋白質(zhì)表達(dá)變化的研究能夠體現(xiàn)在慶

8、大霉素作用早期帶狀突觸功能的變化。 對(duì)藥物性耳聾時(shí)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量和功能變化的研究，為其它原因引起的感音神經(jīng)性聾致病機(jī)理的進(jìn)一步研究打下良好的基礎(chǔ)，例如老年性耳聾、噪聲性耳聾時(shí)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化?？梢赃M(jìn)一步利用電鏡對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸微觀結(jié)構(gòu)的變化加以研究，也可使用電生理方法對(duì)帶狀突觸的功能進(jìn)行深入研究?？傊?，對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的可塑性進(jìn)行研究，是對(duì)感音神經(jīng)性聾致病機(jī)理的新的補(bǔ)充，具有廣泛的研究前景和應(yīng)用前景。

9、 材料和方法： 本實(shí)驗(yàn)選用C57小鼠120只(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，除外耳和中耳疾病，2月齡，體重25±1.23 g。使用ABRs進(jìn)行聽(tīng)力評(píng)估，造模前聽(tīng)力正常，造模后聽(tīng)閾大于30dB。將小鼠隨機(jī)分為2部分。每部分分為6組，每組10只，對(duì)其中的5組使用100mg/kg慶大霉素進(jìn)行腹腔注射，分別注射4d(4d組)、7d(7d組)、10d(10d組)、14d(14d組)、21d(21d組)，另1組為正常對(duì)照組(0d組

10、)。分離小鼠耳蝸基底膜，一部分對(duì)耳蝸基底膜進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)基底膜進(jìn)行序列掃描，并對(duì)所采得的序列掃描圖像利用3ds max8進(jìn)行三維重建，進(jìn)而分析內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的數(shù)量；另一部分使用免疫熒光方法檢測(cè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸囊泡中otoferlin的表達(dá)，采用western blotting對(duì)otoferlin的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果： 一、對(duì)正常組耳蝸基底膜頂回的10個(gè)序列掃描中的內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸進(jìn)行

11、三維建模并計(jì)數(shù)，得出每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞的帶狀突觸數(shù)量為X±SD=16.10±1.032。 一、使用3d max8.0軟件對(duì)各組中內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量進(jìn)行分析，每組中每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞所含的帶狀突觸數(shù)量的數(shù)量以X±SD表示，帶狀突觸在慶大霉素腹腔注射第7d時(shí)數(shù)量最多，6組中每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞包含的帶狀突觸數(shù)量差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。7d組中每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞包含的帶狀突觸數(shù)量顯著多于其它5組。 三、使用免疫熒光方法，F(xiàn)ITC標(biāo)記的ot

12、oferlin呈綠色，位于內(nèi)毛細(xì)胞底部，外毛細(xì)胞僅有纖毛非特異性著色。利用Western blotting檢測(cè)otoferlin的表達(dá)：在140.5kD左右的位置檢測(cè)到otoferlin的表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行半定量分析。注射慶大霉素前otoferlin表達(dá)量較少，在注射第4d時(shí)表達(dá)量增加，第7d時(shí)表達(dá)量最多。各時(shí)間點(diǎn)otoferlin蛋白表達(dá)吸光度比值組間差異顯著(P<0.01)。 結(jié)論： 一、在耳蝸基底膜鋪片中，由于帶狀突

13、觸并非存在于同一平面，為了對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸進(jìn)行數(shù)量分析，使用免疫熒光雙標(biāo)對(duì)突觸結(jié)構(gòu)蛋白及突觸后的受體蛋白進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡序列掃描，最后使用3d max8.0進(jìn)行三維重建，可以得到內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的準(zhǔn)確數(shù)量。 二、在慶大霉素作用早期，內(nèi)毛細(xì)胞的數(shù)量未發(fā)生改變時(shí)，內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的數(shù)量已經(jīng)發(fā)生變化。在慶大霉素腹腔注射的第7d，內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的數(shù)量達(dá)到高峰，之后又出現(xiàn)減少。內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸通過(guò)數(shù)量的改變，增加或減少與

14、螺旋神經(jīng)元之間的神經(jīng)連接。對(duì)慶大霉素的耳毒性起到一定代償作用，但這一作用不足以維持正常聽(tīng)閾。 三、在慶大霉素作用早期，內(nèi)毛細(xì)胞的數(shù)量未發(fā)生改變時(shí)，內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸中otoferlin的表達(dá)已經(jīng)發(fā)生變化。在慶大霉素腹腔注射的第4d，內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸中otoferlin的表達(dá)增加，于第7d達(dá)到高峰，之后表達(dá)下降。提示這種變化可能是帶狀突觸通過(guò)otoferlin表達(dá)的增強(qiáng)，增加了內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的囊泡融合和突觸遞質(zhì)的釋放，在早期對(duì)慶大