人星形膠質(zhì)細(xì)胞增強(qiáng)小鼠海馬齒狀回突觸的可塑性.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目眾多的細(xì)胞之一,在神經(jīng)系統(tǒng)中不但起著支持、營養(yǎng)、保護(hù)的作用,而且還表現(xiàn)調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng),神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,神經(jīng)元突觸電活動(dòng)等諸多重要生物學(xué)功能。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的異?？梢灾苯訉?dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能的異常,許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病和損傷性疾病如阿爾茲海默病,帕金森綜合征,腦缺血后神經(jīng)功能損害程度等都與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及功能活動(dòng)異常有關(guān)。
　　 近年來,中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)一直是科研人員和

2、臨床工作者關(guān)注的重點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞移植已成為神經(jīng)退化性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷的一種嘗試性試驗(yàn)治療手段。眾多行為學(xué)試驗(yàn)表明移植神經(jīng)干細(xì)胞后,損傷的神經(jīng)系統(tǒng)功能有一定程度的改善,形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明移植的部分神經(jīng)干細(xì)胞可以在腦內(nèi)發(fā)育成星形膠質(zhì)細(xì)胞,其對(duì)神經(jīng)功能的改善可能發(fā)揮著一定的影響。但是由于神經(jīng)干細(xì)胞來源的復(fù)雜性,因此,對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞種類、移植時(shí)間的選擇,對(duì)移植的細(xì)胞如何進(jìn)行有效誘導(dǎo)使其分化為目的細(xì)胞及其修復(fù)機(jī)制的探討仍是此類研究的瓶頸。神經(jīng)

3、膠質(zhì)細(xì)胞來自于神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞又由神經(jīng)干細(xì)胞分化而來。目前關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能重建作用的相關(guān)報(bào)道仍不充分星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過釋放ATP,D-絲氨酸,腫瘤壞死因子等生物活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)突觸的數(shù)量,突觸的反應(yīng)強(qiáng)度及突觸間神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。基于以上信息,我們感興趣的是:經(jīng)細(xì)胞移植后分化存活的星形膠質(zhì)細(xì)胞是否會(huì)影響突觸的功能及其可能的機(jī)制。
　　 本課題利用將人神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞移植到正常小鼠腦內(nèi)兩側(cè)側(cè)腦室周區(qū)的

4、動(dòng)物模型,應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法觀察分化的人星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn),觀察人星形膠質(zhì)細(xì)胞的生理學(xué)特性,觀察人星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)小鼠海馬齒狀回突觸活動(dòng)的影響。為探討星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)育與功能特點(diǎn)提供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 一、主要試劑：來自于17—22周的流產(chǎn)人胚的前腦腦室下區(qū)的神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞(A2B5細(xì)胞)和CMV-綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,EGFP)逆轉(zhuǎn)錄病毒由美國羅切

5、斯特大學(xué)的Goldman教授惠贈(zèng)；小鼠抗人核單克隆抗體,小鼠抗人NG2單克隆抗體,兔抗A2B5多克隆抗體(Chemicon,美國),小鼠抗人神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白Hgfap單克隆抗體(Sternberger公司,美國),小鼠抗人線粒體單克隆抗體(USBiological公司,美國),兔抗D-絲氨酸多克隆抗體,雞抗層粘連蛋白多克隆抗體(Abcam公司,美國),小鼠抗NMDARI單克隆抗體,(Sternberger公司,美國),羊抗人腫瘤壞死因子

6、多克隆抗體(R&D systems,美國),羊抗絲氨酸消旋酶多克隆抗體(Santa Cruz,美國),DAPI核DAPI核染色劑和Cy3或Cy5熒光標(biāo)記的二抗(Jackson公司,美國)
　　 二、主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈臺(tái)(Erlab,美國)；共聚焦顯微鏡和Fluview300圖像分析系統(tǒng)((Olympus,日本)；熒光倒置顯微鏡(Olympus,日本)；恒溫冷凍切片機(jī)(Leiea,德國)；-80℃深低溫冰箱(Toshiba

7、,日本)；立體定位微注射儀(USEquipment Co,美國)；雙光子激光顯微鏡(Olympus,日本)；紫外線激光發(fā)生器(US Equipment Co,美國)；電生理描記系統(tǒng)(US Equipment Co,美國)；震蕩切片機(jī)(Leica,德國)；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)記錄箱(Coulboum Instruments,美國)。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新生24h以內(nèi)的Rag2小鼠60只,雌雄不限,購

8、自美國Jackson實(shí)殮室。隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
　　 2、神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：A285細(xì)胞用DMEM/F12/N1無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),其內(nèi)加入20ng/ml Bfgf。轉(zhuǎn)染按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,將細(xì)胞與CMV-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒孵育過夜,棄上清,用DMEM/F12/N1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3-5天。用熒光倒置顯微鏡觀察,轉(zhuǎn)染成功的A285細(xì)胞(表達(dá)綠色熒光蛋白)用于移植實(shí)驗(yàn)。
　　 3、神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的移植:轉(zhuǎn)染

9、后的A285細(xì)胞用胰蛋白酶消化,吹打細(xì)胞懸浮于HBSS中。將出生24h內(nèi)的Rag2小鼠冰上麻醉后,固定于立體定位儀上,用玻璃微量加樣器將1ul(1×105/ul)的細(xì)胞懸液平均注入兩側(cè)側(cè)腦室周區(qū)。
　　 4、免疫組織化學(xué):染色觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 5、膜片鉗方法記錄膠質(zhì)細(xì)胞電生理特性：將400微米厚的腦片置于雙光子激光顯微鏡下,用膜片鉗方法記錄人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),膜電位,細(xì)胞阻抗等生理指標(biāo)。用膜片鉗方法向細(xì)胞內(nèi)注入

10、鈣指示劑(rhod2)與鈣蝥合劑(NP-EGTA),用紫外激光激發(fā)鈣釋放,雙光子顯微鏡下觀察鈣波傳導(dǎo),測(cè)量鈣波傳導(dǎo)速度[42]。
　　 6、電生理LTP實(shí)驗(yàn)：選取含海馬齒狀回的腦片進(jìn)行記錄興奮性突觸后電位和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。在海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(苔蘚纖維)放置記錄電極和刺激電極。
　　 7、TNFa抑制劑給藥方法：小鼠在進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)前10天起,每天給予Thalidomide腹腔注射(500mg/kg,I.p,0.2

11、5-0.3 ml)。
　　 8、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：關(guān)于學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)記錄箱中進(jìn)行。第一個(gè)記錄箱用于訓(xùn)練動(dòng)物,第二個(gè)記錄箱用于檢測(cè)和錄像記錄。小鼠在箱內(nèi)適應(yīng)3分鐘后,給予長(zhǎng)達(dá)30秒420HZ的聲音刺激,在聲音刺激結(jié)束后,給予2秒鐘0.3mA的電流刺激足部。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Freezeview software軟件進(jìn)行分析9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,用Sigma stat8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,差異顯著

12、性采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)觀察神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功表達(dá)綠色熒光蛋白。轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)5天后,細(xì)胞分化為扁平梭形多突起的細(xì)胞,A2B5免疫熒光染色為陽性。
　　 2、神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的分布移植6個(gè)月后,可見分化的神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞主要分布于皮層,胼胝體,海馬和側(cè)腦室周圍,細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。
　　 3、神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的分化和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)免疫熒光染色結(jié)果表明,移

13、植后的細(xì)胞主要分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞,并體現(xiàn)人星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):細(xì)胞大,突起多,突起長(zhǎng),線立體沿細(xì)胞長(zhǎng)突起排列,突起末端與血管接觸。海馬中可見Hng2表達(dá)陽性的細(xì)胞。
　　 4、人星形膠質(zhì)細(xì)胞的生理學(xué)特性與鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,人星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞阻抗略高,靜息膜電位無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。紫外激光激發(fā)實(shí)驗(yàn)顯示鈣波可沿人星形膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)突起傳遞,人星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣波傳導(dǎo)速度比鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞快。
　　 5、Fepsp和LTP實(shí)驗(yàn)在不同的

14、強(qiáng)度刺激下,實(shí)驗(yàn)組的Fepsp明顯高于對(duì)照組。LTP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HFS后,實(shí)驗(yàn)組的Fepsp反應(yīng)可持續(xù)60分鐘,而對(duì)照組回到基線。兩者的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、免疫染色分析TNFa和GluRl的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的TNFa和Glugl的表達(dá)均高于對(duì)照組,而NRl的表達(dá)在兩者并無明顯區(qū)別。注射Thalidomide后,實(shí)驗(yàn)組TNFa和GluRl的表達(dá)均低于對(duì)照組,NRl的表達(dá)在兩者并無明顯區(qū)別。
　　 7、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分析學(xué)習(xí)

15、記憶能力的差異實(shí)驗(yàn)組的小鼠學(xué)習(xí)和記憶的能力明顯高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：
　　 1、將人神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞移植入正常小鼠腦內(nèi)兩側(cè)側(cè)腦室周區(qū)后,細(xì)胞在移植部位存活、分化、增殖并體現(xiàn)人星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　 2、分化的人星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與了宿主腦內(nèi)血腦屏障的形成。
　　 3、分化的人星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)人細(xì)胞的電生理學(xué)特性,鈣波傳導(dǎo)速度比鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞快。
　　 4、人星形膠質(zhì)細(xì)胞加強(qiáng)了小鼠海馬