助陽寧神方拮抗應激致抑郁小鼠海馬星形膠質細胞可塑性損傷的作用研究.pdf

1、研究目的
　　 依據(jù)中醫(yī)臨床“助陽入腦，降火寧神”的治療抑郁癥的新思想創(chuàng)制助陽寧神方，該方在臨床上確具較好療效。研究發(fā)現(xiàn)其作用機制可能不是通過影響單胺類神經(jīng)遞質而產(chǎn)生，而可能與星形膠質細胞可塑性改變有關。為此，本課題采用皮質酮注射制備抑郁動物模型，從非單胺類神經(jīng)遞質假說中的星形膠質細胞可塑性入手，觀察應激和助陽寧神方(Zhuyang-ningshen Formula，ZNF)作用前后星形膠質細胞可塑性變化：包括GFAP蛋白的表達

2、改變、星形膠質細胞形態(tài)、數(shù)量等，期望探究助陽寧神方在該模型的效應，闡明調節(jié)海馬星形膠質細胞可塑性是助陽寧神方臨床改善抑郁癥的作用機制，從而使“助陽入腦，降火寧神”思想得到實驗證實，為抑郁癥防治和新藥研發(fā)提供科學的實驗理論依據(jù)。
　　 研究方法
　　 (1)助陽寧神方藥效學研究
　　 采用利血平拮抗模型觀察小鼠閉眼率；5-羥色氨酸（5-hydroxytryptophane,5-HTP）誘導的甩頭行為模型觀測甩頭率及

3、甩頭次數(shù)；育亨賓毒性模型觀測各組小鼠死亡率；懸尾實驗觀測行為學改變。
　　 (2)抑郁小鼠模型制備及助陽寧神方抗抑郁有效性驗證實驗研究
　　 皮質酮皮下注射制備抑郁動物模型，實驗分為6組，分別是正常組、模型組、氟西汀組，助陽寧神方低劑量組(1.9g/kg)、中劑量組(3.8g/kg)和高劑量組(7.6g/kg)，每組8只，共48只C57BL/6N小鼠；采用強迫游泳、強迫懸尾觀察給藥4周后小鼠行為學改變和體重變化，然后處死

4、動物，快速取腦剝離海馬，Western blot蛋白免疫印跡檢測神經(jīng)元NF-L、SY-P蛋白表達變化，同時，觀測助陽寧神方對該模型的拮抗作用。
　　 (3)基于星形膠質細胞可塑性的助陽寧神方抗抑郁作用機制研究
　　 實驗分6組，分別是正常組、模型組、氟西汀組，助陽寧神方低劑量組(1.9g/kg)、中劑量組(3.8g/kg)和高劑量組(7.6g/kg)，每組12只C57BL/6N小鼠，共72只小鼠。給藥4周后，采用West

5、ern blot及免疫組化技術觀測海馬膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、BDNF和GDNF表達改變，體視學分析技術檢測海馬GFAP表達陽性細胞數(shù)。
　　 研究結果
　　 (1)助陽寧神方藥效學研究結果
　　 1)利血平拮抗模型
　　 與模型組閉眼率100％比，氟西汀組閉眼率為30%，閉眼率顯著降低(P＜0.01)，助陽寧神方高、中、低劑量組閉眼率依次為60%、50%、40%，閉眼率也顯著性降低(P＜0.05、

6、P＜0.05、P＜0.01)，與氟西汀組比，助陽寧神方高、中、低劑量組閉眼率隨劑量下降，閉眼率逐漸下降，但無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2)5-HTP誘導的甩頭行為模型
　　 連續(xù)給藥第3天、第7天15min后，正常組、氟西汀組、助陽寧神方高、中、低劑量組甩頭率分別為：40%、80%、50%、40%和30%;40%、90%、40%、30%和20%，與正常組比，氟西汀組甩頭率明顯增加(P＜0.01)，而ZNF高、中

7、、低劑量組均未增加甩頭率（P均＞0.05）；與氟西汀組比，ZNF高、中、低劑量組均甩頭率顯著下降(P＜0.01)；第7天15min后，各相應組甩頭次數(shù)依次為70次、246次、53次、27次和34次；ZNF各組甩頭次數(shù)與正常組比無顯著上升（P均＞0.05）。
　　 3)育亨賓毒性模型
　　 正常組、氟西汀組、ZNF高、中、低劑量組死亡小鼠依次為1只、5只、2只、1只、1只，與正常組比，氟西汀組小鼠死亡率顯著升高(P＜0.0

8、1)，而ZNF各組小鼠死亡率未顯著上升(P＞0.05)，與氟西汀組比，ZNF各組小鼠死亡率顯著下降（P均＜0.01）。
　　 4)懸尾實驗
　　 與正常組比，氟西汀組、ZNF高、中、低劑量組懸尾不動時間顯著縮短(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 (2)皮質酮致抑郁小鼠模型建立及助陽寧神方有效性驗證實驗結果
　　 1)體重變化結果
　　 各實驗組起始體重無顯著性差異（P均＞0.05）,4周后，模

9、型組動物較正常組動物體重明顯減輕(P＜0.05)，但其他各組與模型組比，均具有上調體重趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)。
　　 2)行為學實驗研究結果
　　 在懸尾實驗、強迫游泳中，與正常組比，模型組不動時間明顯延長(P＜0.01，P＜0.05)，與模型組比，氟西汀組不動時間明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05)，助陽寧神方中((P＜0．01，P＜0.05)、低劑量組（P均＜0.05）不動時間也顯著縮短，助陽寧神方

10、高劑量組不動時間未見顯著縮短(P＞0.05)。
　　 3)western blot免疫印跡實驗結果
　　 與正常組比，模型組NF-L、SYP表達水平顯著下降(P＜0.01、P＜0.05)；與模型組比，氟西汀組NF-L、SYP表達水平顯著上調(P＜0.01、P＜0.05)，助陽寧神方高、中、低劑量組均能明顯上調NF-L、SYP表達水平（P均＜0.05）。
　　 (3)基于星形膠質細胞可塑性的助陽寧神方抗抑郁作用機制

11、研究結果
　　 1)western blot免疫印跡實驗結果
　　 與正常組比，模型組GFAP、BDNF及GDNF的表達較正常組水平顯著下調(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01),與模型組比，氟西汀組除GDNF未見顯著上調外，其他指標均顯著上調(P＜0.05或P＜0.01)，助陽寧神方中、低劑量組均能顯著上調GFAP、BDNF及GDNF的蛋白表達水平(P＜0.05或P＜0.01)，而ZNF高劑量組顯著上調GFAP及

12、GDNF(P＜0.05或P＜0.01)，而對BDNF卻無顯著上調作用(P＞0.05)。
　　 2)免疫組化表達結果
　　 在海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)，與正常組比，模型組GFAP陽性區(qū)域總光密度值和面積均明顯下調(P＜0.05或P＜0.01)，與模型組比，氟西汀組、助陽寧神方高、中、低劑量組均能顯著上調GFAP陽性區(qū)域總光密度值（P＜0.05或P＜0.01）；在CA3區(qū)助陽寧神方高、中劑量組及在CA1區(qū)助陽寧神方中劑量組GF

13、AP陽性表達區(qū)域面積明顯上調(P＜0.05或P＜0．01)；在DG區(qū)，氟西汀組、助陽寧神方高、中、低劑量組GFAP陽性表達區(qū)域總光密度值顯著上調(P＜0.05或P＜0.01)，但GFAP陽性表達區(qū)域面積均無明顯上調(P＞0．05)。
　　 3)體視學分析結果
　　 與正常組比，模型組海馬GFAP陽性細胞（星形膠質細胞）個數(shù)顯著下調(P＜0.05)，與模型組比，氟西汀組、ZNF高、中劑量組能顯著上調GFAP陽性細胞(P＜0