Akt1 SUMO化在突觸可塑性中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：SUMO化是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。研究發(fā)現(xiàn)，在不同的刺激下，突觸前膜蛋白SUMO化水平會(huì)發(fā)生不同的改變，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響突觸可塑性;SUMO化是否參與了突觸可塑性，以及在突觸可塑性中發(fā)生SUMO化的靶蛋白和它們的作用機(jī)制尚不明確。Akt1是Akt家族的成員之一，是突觸可塑性中的廣泛作用蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Akt1參與了海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)的調(diào)控，但是

2、Akt1在突觸可塑性中的具體作用機(jī)制目前仍未闡明。本課題旨在研究Akt1 SUMO化對(duì)LTP的調(diào)控及Akt1 SUMO化對(duì)Akt1活性的調(diào)節(jié)，進(jìn)而揭示Akt1在突觸可塑性中的作用機(jī)制。
　　方法：采用Bicuculline刺激皮質(zhì)神經(jīng)元建立化學(xué)LTP細(xì)胞模型來研究Akt1SUMO化在突觸可塑性中的作用;Bicuculline作用前30 min分別給以NMDA受體的不可逆抑制劑MK801、NMDA受體亞基GluN2A的特異性抑制劑N

3、VP-AMM077(NVP)、GluN2B的特異性抑制劑Ro25-6981(Ro)抑制其活性，來研究NMDA受體對(duì)Akt1 SUMO化的調(diào)控;采用體外激酶反應(yīng)來研究SUMO化對(duì)Akt1活性的影響;采用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建Akt1 SUMO化位點(diǎn)的突變體，鑒定Akt1的SUMO化位點(diǎn);采用免疫印跡、免疫共沉淀方法來研究Akt1 SUMO化、蛋白的表達(dá)及PIASs與Akt1的相互作用。
　　結(jié)果：1.Akt1可與SUMO1共價(jià)結(jié)合。

4、2.Bicuculline誘導(dǎo)LTP后，Akt1 SUMO化水平呈上升的趨勢(shì)，在12 h達(dá)到最高，達(dá)到對(duì)照組的3倍。3.LTP組中PIAS1-Akt1，PIAS2-Akt1，PIAS3-Akt1相互作用較對(duì)照組都有明顯的升高。4.MK801、NVP組Akt1 SUMO化水平與Bicuculline組相比顯著降低，Ro組Akt1SUMO化水平與Bicuculline組相比無明顯差別。5.Myc-Akt1(WT)及Myc-Akt1(K64R

5、, K182R, K189R, K276R, K64+276R)真核表達(dá)載體成功構(gòu)建。6.共表達(dá)Myc-Akt1與有活性的SUMO1組Akt1 SUMO化水平明顯高于空細(xì)胞組、單轉(zhuǎn)Myc-Akt1組及Myc-Akt1與失活SUMO1共表達(dá)組。7.突變體Akt1(K64R,276R)SUMO化水平與WT組相比有顯著降低，突變體Akt1(K182R, K189R)的SUMO化水平與WT組相比無顯著變化。Akt1的雙賴氨酸突變體Akt1(K6

6、4+276R)SUMO化水平與WT組及Akt1(K64R)組、Akt1(K276R)組相比都有顯著的降低。8.體外激酶反應(yīng)結(jié)果顯示Akt1(K64+276R)組Akt1活性顯著低于WT組。9.Akt1(K64+276R)組Ser473磷酸化水平與WT組相比無顯著差別而Thr308磷酸化水平則有顯著降低。10.BDNF在K64+276R組中的表達(dá)較WT組有顯著的降低。
　　結(jié)論：1.LTP促進(jìn)Akt1 SUMO化。2.NMDA受體亞