SRC-1在雄激素調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶中的作用及其機制的初步研究.pdf

1、眾所周知,雄激素對腦的結(jié)構(gòu)和功能有多方面重要的調(diào)節(jié)作用,但是具體機制尚不清楚。在人類,老化相關(guān)的雄激素水平下降與認知障礙有關(guān)且是老年癡呆的危險因子,流行病學(xué)研究表明老年群體中較低雄激素水平的人群其認知功能同樣也較低且更容易發(fā)展為老年癡呆。來自動物的實驗證據(jù)表明雄激素參與調(diào)節(jié)腦的結(jié)構(gòu)與功能的性別差異,特別是情緒、認知、學(xué)習(xí)記憶以及生殖功能等。在腦內(nèi),雄激素發(fā)揮作用可以有兩種方式,一是通過其受體的直接方式,另一種為通過芳香化酶(aromat

2、ase,AROM)催化將其轉(zhuǎn)化為雌激素(通常稱為local estrogen即內(nèi)源性雌激素,主要是雌二醇estradiol, E2)的間接方式,根據(jù)芳香化酶假說該方式直接決定了腦發(fā)育的性別差異。在直接方式中,雄激素與相應(yīng)的受體即雄激素受體(androgen receptor, AR)結(jié)合進而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在間接方式中,經(jīng)由AROM催化雄激素轉(zhuǎn)化而來的E2可通過其核受體(estrogen receptorα和β, ERα和ERβ)結(jié)合

3、發(fā)揮經(jīng)典的基因型調(diào)節(jié)效應(yīng),即調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的方式;或通過其與G蛋白耦聯(lián)的、位于細胞膜和/或細胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)如線粒體的膜性受體(G-protein coupled membranous estrogen receptor, GPER)結(jié)合進而通過胞漿內(nèi)的第二信使系統(tǒng)發(fā)揮“非經(jīng)典的”、產(chǎn)生快速生理效應(yīng)的非基因型效應(yīng)。經(jīng)典的類固醇激素受體包括AR、ERα和ERβ都位于細胞核內(nèi),屬于核受體超家族成員,然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)多種經(jīng)典的核受體在某些情況

4、下也可位于胞漿甚至細胞膜且能通過第二信使系統(tǒng)發(fā)揮快速的非基因型調(diào)節(jié)作用,因此無論是雄激素還是雌激素,其具體的作用機制都非常復(fù)雜。目前認為,類固醇激素通過核受體調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的方式是類固醇激素發(fā)揮作用的主要方式。在此過程中的基本調(diào)節(jié)模式是:激素與核受體結(jié)合,捕獲輔助活化因子(coactivator)或輔助抑制因子(corepressor),再捕獲其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與RNA聚合酶等多種轉(zhuǎn)錄所需元件,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄開始。
　　已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種

5、輔助活化因子,它們分別在不同的組織、器官或細胞內(nèi)發(fā)揮作用,目前對p160家族研究得最多最深入。該家族包括三個成員,即類固醇受體輔助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1, SRC-1)、SRC-2和SRC-3,其分子量均為160kDa。SRC-1主要見于腦內(nèi),SRC-2和 SRC-3主要見于外周組織,其中 SRC-1是發(fā)現(xiàn)最早、腦內(nèi)分布最廣的類固醇受體輔助活化因子,敲除該基因?qū)е逻\動學(xué)習(xí)障礙和小腦浦肯

6、野細胞發(fā)育延遲,下丘腦注射SRC-1反義寡核苷酸證明它參與了對生殖功能的調(diào)控,但是到目前為止它在腦內(nèi)的功能總體來說還很不清楚。前人的研究報道了SRC-1蛋白高表達于海馬神經(jīng)元內(nèi),神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達很少甚至不表達;我們前期工作報道了腦內(nèi)SRC-1蛋白的表達具有明顯的性別差異,在雄性小鼠的多數(shù)腦區(qū)其表達都顯著高于雌性的對應(yīng)腦區(qū);我們還報道其表達隨老化而降低,且主要見于與學(xué)習(xí)記憶、運動等有關(guān)的腦區(qū)如海馬、黑質(zhì)等。由于海馬是與學(xué)習(xí)記憶、情緒和

7、認知關(guān)系最密切的腦區(qū),海馬的突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ),前人和我們的前期工作都顯示海馬內(nèi)有高水平的 SRC-1蛋白表達,推測它可能參與了性激素對海馬功能特別是突觸可塑性的調(diào)節(jié),為此我們采用性腺切除實驗初步探討了性激素對海馬SRC-1表達的影響,意外地觀察到卵巢切除僅短時影響海馬SRC-1的表達,而睪丸切除后海馬SRC-1的表達持續(xù)顯著降低,強烈提示SRC-1可能主要參與了睪丸雄激素而不是卵巢雌激素對海馬結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié),然而SRC-1是

8、否或如何介導(dǎo)雄激素對海馬結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)尚未見任何文獻報道。
　　有鑒于此,本課題研究采用免疫組織化學(xué)、Western blot、透射電鏡、Morris水迷宮、RNA干擾、免疫共沉淀等技術(shù)方法,首先檢測了睪丸切除或芳香化酶抑制劑處理后全腦內(nèi)各腦區(qū)SRC-1的表達變化,為進一步研究SRC-1可能參與了雄激素或內(nèi)源性雌激素的哪些功能提供線索;然后采用睪丸切除(Orchiectomy, ORX)和/或芳香化酶抑制劑來曲唑(Letrozo

9、le, LET)處理觀察海馬SRC-1表達與突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶改變之間的相關(guān)性;接下來進一步通過RNA干擾實驗抑制海馬SRC-1表達后檢測了小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬突觸可塑性的變化;最后用小鼠海馬神經(jīng)元細胞株的體外實驗證實了SRC-1對突觸蛋白的抑制并對其可能機制進行了初步研究,主要結(jié)果如下:
　　1.SRC-1免疫陽性產(chǎn)物在成年雄性小鼠大腦的端腦、間腦、腦干和小腦等腦區(qū)廣泛表達,主要定位于細胞核。ORX處理1個月后梨狀皮質(zhì)、嗅結(jié)節(jié)、

10、海馬、下丘腦背外側(cè)核、腹外側(cè)核及黑質(zhì)等部位SRC-1蛋白的表達水平顯著下降; LET處理1個月后隔內(nèi)側(cè)核、海馬、背內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、上丘、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)以及上橄欖旁核等核團內(nèi)SRC-1蛋白表達水平顯著下降。
　　2.ORX和LET處理1個月后海馬SRC-1及突觸可塑性相關(guān)蛋白谷氨酸受體GluR1、突觸后密度蛋白-95(PSD-95)、樹突棘素(Spinophilin)的表達較對照組顯著降低,且變化模式高度相關(guān);LET處

11、理對SRC-1和突觸蛋白的抑制較ORX處理更顯著。透射電鏡結(jié)果顯示ORX和LET均能調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)的突觸密度與突觸形態(tài),但是LET較ORX的作用更強;而Morris水迷宮測試中,LET能夠顯著增加雄性小鼠的潛伏期,同時降低在目標(biāo)象限的停留時間,而ORX對學(xué)習(xí)記憶行為無影響。
　　3.ORX后再給予LET的聯(lián)合處理與單獨應(yīng)用LET的效果一致,并未引起海馬突觸蛋白表達、突觸密度的進一步降低以及更嚴重的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　4.立

12、體定位注射SRC-1 shRNA慢病毒可顯著抑制海馬SRC-1表達,并顯著下調(diào)突觸蛋白GluR1、PSD-95、spinophilin以及ERα、ERβ、AR的表達;海馬CA1區(qū)棘突觸密度及突觸后致密物的厚度顯著降低; Morris水迷宮實驗表明小鼠有顯著的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　5.小鼠海馬神經(jīng)元細胞株mHippoE-14可表達神經(jīng)元的各種標(biāo)記物、多種突觸蛋白以及核受體和SRC-1。體外培養(yǎng)的mHippoE-14細胞用SRC

13、-1 shRNA抑制SRC-1表達后同樣可下調(diào) GluR1、PSD-95、Spinophilin等突觸蛋白表達以及磷酸化 CREB的水平;免疫共沉淀結(jié)果顯示SRC-1與磷酸化CREB存在直接的相互結(jié)合關(guān)系,且SRC-1表達受到抑制后其與磷酸化CREB相互結(jié)合的作用力顯著降低。
　　主要結(jié)論:
　　1.ORX和LET均可顯著降低多個腦區(qū)內(nèi)SRC-1的表達,表明SRC-1可介導(dǎo)睪丸雄激素和內(nèi)源性雌激素對腦的結(jié)構(gòu)和功能多方面的調(diào)節(jié)

14、。在與學(xué)習(xí)記憶、運動、神經(jīng)內(nèi)分泌、生殖和神經(jīng)信息整合有關(guān)的腦區(qū)如基底前腦、海馬、下丘腦、中腦,兩種處理導(dǎo)致SRC-1的降低都很明顯,強烈提示SRC-1介導(dǎo)了雄激素對這些核團的直接或間接效應(yīng)。
　　2.ORX或LET對海馬的SRC-1表達和突觸可塑性均有一定的調(diào)節(jié)作用,以LET的效應(yīng)更明顯;行為學(xué)測試顯示僅LET可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶行為的改變,表明內(nèi)源性雌激素比循環(huán)雄激素對海馬SRC-1和學(xué)習(xí)記憶的影響更顯著。
　　3.ORX+LE

15、T聯(lián)合處理不能導(dǎo)致突觸可塑性的進一步下降,可能是LET處理導(dǎo)致的內(nèi)源性雌激素水平或 SRC-1表達的下降達到了某種“閾值”、因而 ORX后給予LET處理并未能進一步引起突觸蛋白表達、突觸密度的降低以及學(xué)習(xí)記憶行為的變化,同樣表明內(nèi)源性雌激素對調(diào)節(jié)海馬SRC-1的表達、突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力的重要性。
　　4.在體應(yīng)用SRC-1 shRNA慢病毒抑制海馬神經(jīng)元SRC-1表達后突觸可塑性的顯著下降和學(xué)習(xí)記憶能力的下降。離體實驗進一步

16、證實了抑制神經(jīng)元SRC-1表達可導(dǎo)致突觸蛋白表達的顯著下降以及磷酸化 CREB水平的下降。免疫共沉淀實驗結(jié)果提示SRC-1和磷酸化 CREB能相互作用且受到 SRC-1表達水平的調(diào)節(jié),提示 SRC-1能捕獲磷酸化CREB進而調(diào)節(jié)突觸蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,最終對學(xué)習(xí)記憶行為產(chǎn)生深刻影響。
　　本課題通過一系列實驗研究證實SRC-1介導(dǎo)了雄激素對海馬的突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶行為的調(diào)節(jié)作用,并初步探討可能的調(diào)節(jié)機制,同時我們還注意到內(nèi)源性雌激

17、素在調(diào)控海馬突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶方面可能具有較雄激素更重要的作用。本課題的研究為進一步深入闡明SRC-1在腦內(nèi)的表達與功能提供了新的實驗證據(jù),為開發(fā)預(yù)防和治療學(xué)習(xí)記憶與認知障礙的藥物提供了新的靶點。由于老化相關(guān)的雄激素水平下降與認知障礙有關(guān)且是老年癡呆的危險因子,激素替代治療包括雄激素替代和雌激素替代已經(jīng)開始臨床實驗,用于預(yù)防或改善老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)以及帕金森病(Pa