環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的抗雄激素活性與性腺發(fā)育不良發(fā)病的關(guān)系及其中藥拮抗治療的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:(1)通過染毒動物實(shí)驗(yàn)，觀察環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrinedisruptor，EEDs)的抗雄激素活性及生殖毒性，復(fù)制其引致性腺發(fā)育不良的疾病模型。(2)在此疾病模型上，采用益腎填精中藥治療干預(yù)，驗(yàn)證中藥對EEDs抗雄激素活性及生殖毒性的拮抗作用。(3)采用生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，從睪丸支持細(xì)胞功能角度研究并闡明EEDs抗雄激素活性的作用機(jī)制及中藥對其的拮抗作用機(jī)制，為開發(fā)有效拮抗EEDs生

2、殖毒性的中藥制劑提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)以青春前期（21日齡）雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，選取具有代表性的EEDs——鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexylphthalate，DEHP）及氯氰菊酯(Cypermethrin，CYP)作為染毒物質(zhì)。40只雄性青春前期SD大鼠隨機(jī)分為對照組（喂飼玉米油）、DEHP染毒組（喂飼DEHP500 mg/kg）、CYP染毒組(喂飼CYP80mg/kg)及聯(lián)合染毒組（

3、喂飼DEHP500 mg/kg+CYP80mg/kg），每組10只。每日空腹給藥，連續(xù)染毒4周。以睪丸下降時間、包皮分離時間、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、血清睪酮水平、睪丸病理組織學(xué)改變、睪丸超微結(jié)構(gòu)病變作為指標(biāo)觀察DEHP及CYP的抗雄激素活性及生殖毒性，復(fù)制其引致性腺發(fā)育不良的疾病模型。通過檢測卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)、雄激素結(jié)合蛋白(androgen bindi

4、ng protein，ABP)、抑制素(inhibin，INH)、波形蛋白(vimentin，VIM)的基因與蛋白表達(dá)水平從睪丸支持細(xì)胞功能的角度探討DEHP及CYP抗雄激素活性及其生殖毒性的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2×2析因方差分析，對比各組間的差異，通過交互圖判斷DEHP與CYP的交互作用。(2)在此性腺發(fā)育不良疾病模型采用益腎填精中藥治療干預(yù)。70只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組（喂飼玉米油）、DEHP染毒組(DEHP500 mg/kg

5、)、CYP染毒組(CYP80mg/kg)和聯(lián)合染毒組(DEHP500 mg/kg+CYP80mg/kg)，治療組同時喂飼中藥。每日空腹給藥，連續(xù)染毒4周。以睪丸下降時間、包皮分離時間、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、血清睪酮水平、睪丸病理組織學(xué)改變、睪丸超微結(jié)構(gòu)病變作為指標(biāo)，驗(yàn)證益腎填精中藥對EEDs抗雄激素作用及其生殖毒性的拮抗作用。(3)采用生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，檢測睪丸組織氧化應(yīng)激水平，以及FSHR、ABP、INHB、VIM及過氧化物

6、增殖受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的基因與蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，通過染毒組，治療組及對照組的相互對比，從睪丸支持細(xì)胞功能的角度探討益腎填精中藥拮抗EEDs抗雄激素活性及生殖毒性的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)與對照組相比，DEHP、CYP單獨(dú)及聯(lián)合染毒組睪丸重量、睪丸系數(shù)均顯著降低，睪丸下降及包皮分離時間明顯延遲，血清睪酮水平

7、顯著下降，睪丸組織的氧化應(yīng)激水平顯著亢進(jìn)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），各染毒組睪丸病理組織學(xué)及生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均可見不同程度的病變。睪丸支持細(xì)胞功能相關(guān)的基因與蛋白均出現(xiàn)不同程度的改變。各治療組與染毒組相比，上述指標(biāo)均顯著改善(P＜0.05或P＜0.01)。(2) FQ-PCR方法檢測顯示DEHP及CYP單獨(dú)及聯(lián)合染毒睪丸支持細(xì)胞FSHR、ABP、INH及VIM的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，PPAR的mRNA表達(dá)水平

8、顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，而益腎填精中藥治療干預(yù)組睪丸支持細(xì)胞FSHR、ABP、INH、VIM的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，PPARγ的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。(3) Western Blot方法驗(yàn)證，DEHP及CYP單獨(dú)及聯(lián)合染毒組睪丸支持細(xì)胞FSHR、ABP及INH的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，PPARγ的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而益腎填精中藥干預(yù)組FSHR、ABP及INH的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，PPAR

9、γ的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1)通過染毒動物實(shí)驗(yàn)，我們成功地復(fù)制了青春前期大鼠由EEDs引致的性腺發(fā)育不良疾病模型。(2) DEHP及CYP均具有顯著的抗雄激素活性及生殖毒性，并顯著促進(jìn)睪丸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。DEHP對睪丸支持細(xì)胞具有顯著毒性，可明顯降低睪丸支持細(xì)胞功能相關(guān)的基因與蛋白表達(dá)，CYP對睪丸支持細(xì)胞的毒性作用較弱。二者聯(lián)合染毒呈一定拮抗效應(yīng)。(3)益腎填精中藥對EEDs的抗雄激素