環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對垂體~性腺軸相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不良影響及其中藥治療的拮抗作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 (1)通過染毒動物實(shí)驗(yàn)，觀察環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmentalendocrine disruptor，EEDs)的擬雌激素作用及中藥對其擬雌激素活性的拮抗作用，以驗(yàn)證既往的臨床研究結(jié)果。
　　 (2)采用功能基因組學(xué)方法，研究EEDs對垂體-性腺軸功能相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不良影響及其中藥治療干預(yù)的拮抗作用，以闡明中藥拮抗作用的機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)以三周齡的雌性SD大鼠

2、為實(shí)驗(yàn)對象，選取具有代表性的EEDs-壬基酚(4-nonylphenol，NP)、雙酚A(bisphenol A，BPA)作為染毒物質(zhì)，復(fù)制NP單獨(dú)染毒及NP+BPA聯(lián)合染毒的動物模型，治療組同時(shí)喂飼中藥，進(jìn)行治療干預(yù)，療程15天。以子宮濕重、子宮臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺體數(shù)及腺上皮高度，環(huán)形平滑肌厚度、子宮內(nèi)膜及肌層的細(xì)胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白

3、表達(dá)水平及雌激素受體蛋白(estrogen receptor，ER)表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)方法)作為檢測指標(biāo)，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察EEDs的擬雌激素作用及中藥對其擬雌激素活性的拮抗作用。
　　 (2)采用illumina大鼠全基因組表達(dá)譜芯片(ratrer-12)，在與垂體-性腺軸功能相關(guān)的系列基因中大規(guī)模篩選其表達(dá)譜受EEDs染毒后產(chǎn)生顯著變化而中藥治療干預(yù)可產(chǎn)生顯著拮抗作用的基因。對篩選出的系列基因再采用實(shí)時(shí)

4、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time FQ-PCR)及免疫印跡方法(westernblot)分別從基因表達(dá)及蛋白表達(dá)的水平進(jìn)一步加以驗(yàn)證。結(jié)果采用單因素方差分析。
　　 (3)對芯片關(guān)注及驗(yàn)證確定的所有相關(guān)基因，按三個(gè)功能系列加以分類：
　　 ①垂體促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)及受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的系列基因。
　　 ②卵巢雌激素受體及受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的系列基因。
　　 ③卵巢上與雌

5、激素合成代謝相關(guān)的系列酶基因。
　　 結(jié)果：
　　 (1)染毒組與對照組比較，子宮濕重、子宮臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺體數(shù)及腺上皮高度、環(huán)形平滑肌厚度顯著增加(p<0.05)，子宮內(nèi)膜及肌層的PCNA蛋白表達(dá)、ER蛋白表達(dá)顯著增高(p<0.05)。治療組與染毒組相比，上述各指標(biāo)均明顯降低(p<0.05)。
　　 (2)Illumina Beadchip基因芯片(ratref-12)分析結(jié)果顯示，垂

6、體GnRHR及受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的系列基因中，在染毒及中藥干預(yù)治療8天時(shí)，LHβ、FSHβ的mRNA均表現(xiàn)為染毒組表達(dá)上調(diào)、治療組表達(dá)下調(diào)。GnRH受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的磷脂酶C(PLCd1、PLC11、PLCb2、PLCg2)、二酰甘油DG(DGat2、DGkq)、蛋白激酶CPKC(PrKCb1)、脂氧合酶(Alox15、Alox5、Alox3、Alox12)、白細(xì)胞三烯(1tb4r2、1tc4s、1tb4dh)在染毒組表達(dá)水平上

7、調(diào)，治療組表達(dá)水平下調(diào)。脂氧合酶Alox15在芯片中表現(xiàn)為差異基因；卵巢雌激素受體及受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的系列基因中，ERα、ERβmRNA在染毒后8、15天均表達(dá)上調(diào)、治療后表達(dá)下調(diào)。ER的共激活因子Sra1、交叉對話的EGF、EGFR、IGFb2、IGFr2 mRNA表達(dá)染毒后上調(diào)、治療后下調(diào)。其中EGFR在芯片上表現(xiàn)為差異基因，變化趨勢與ER相一致；卵巢上與雌激素合成代謝相關(guān)的系列酶基因中，染毒組與對照組比較，表達(dá)上調(diào)的差異基因

8、有stAR、CYP19al。而治療組與染毒組比較，表達(dá)水平下調(diào)的差異基因有stAR、CYP11A1。
　　 (3)經(jīng)real-time PCR及westernblot進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示，NP及BPA染毒可使卵巢ERα、ERβ、EGFR、StAR、CYP19al的mRNA水平顯著上調(diào)(p<0.05)，ERα、ERβ、stAR、CYP19al、Cyp11A1蛋白表達(dá)明顯增加(p<0.05)；中藥干預(yù)則可使ERα、ERβ、EGFR、s

9、tAR、Cyp11a1的mRNA水平顯著下調(diào)(p<0.05)，ERα、ERβ、stAR、Cyp11A1蛋白表達(dá)顯著減少(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)通過染毒動物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了EEDs的擬雌激素活性及中藥治療干預(yù)對其擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用，驗(yàn)證了我們既往的臨床研究結(jié)果。
　　 (2)EEDs可顯著促進(jìn)與垂體-性腺軸功能相關(guān)的系列基因的表達(dá)水平上調(diào)，從而發(fā)揮其擬雌激素活性。
　　 (3)