爪哇猴由環(huán)境內分泌干擾物引致性早熟疾病模型的建立及中藥作用機制的研究.pdf

1、目的:(1)建立靈長類—爪哇猴由環(huán)境內分泌干擾物(environmental endocrinedisruptors，EEDs)引致的性早熟疾病模型。(2)在爪哇猴性早熟模型上驗證滋陰瀉火中藥對EEDs擬雌激素活性的拮抗作用，以更準確地模擬人類的疾病過程及藥物的治療作用。(3)采用分子生物學實驗方法，研究并闡明中藥拮抗EEDs擬雌激素活性的作用機制，為開發(fā)具有自主知識產權的有效拮抗EEDs生殖毒性的中藥制劑提供更為恰當?shù)睦碚撘罁?jù)。

2、>　　方法:(1)預實驗:以青春前期雌性爪哇猴為實驗對象，選取具有代表性的EEDs—壬基酚(4-nonylphenol，4-NP)及雙酚A(bisphenol A，BPA)作為染毒物質，復制爪哇猴性早熟的疾病模型。爪哇猴分為兩個月齡組，每個年齡組分高劑量染毒組、低劑量染毒組及對照組。每日空腹給藥。以陰道脫落細胞成熟指數(shù)、子宮容積、子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內膜厚度、子宮肌層厚度、子宮內膜上皮細胞高度、子宮腺上皮高度為指標。結果采用單因素方

3、差分析，觀察EEDs的擬雌激素作用。確定爪哇猴性早熟疾病模型建立的最佳月齡、最佳染毒劑量及最佳染毒時間。(2)以最佳月齡的青春前期雌性爪哇猴為實驗對象，以最佳劑量的壬基酚(nonylphenol，4-NP)及雙酚A(bisphenol A，BPA)復制聯(lián)合染毒的性早熟疾病模型。爪哇猴隨機分為染毒組，治療組及對照組，每日空腹給藥。染毒組喂飼4-NP及BPA，治療組喂飼4-NP、BPA及中藥，對照組喂飼溶劑玉米油。以雌激素水平、陰道脫落細胞

4、成熟指數(shù)、子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內膜厚度、子宮肌層厚度、子宮內膜上皮細胞高度、子宮腺上皮高度為指標，結果采用單因素方差分析，驗證中藥對EEDs擬雌激素活性的拮抗作用。(3)采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)及免疫印跡方法（Western Blotting）方法，檢測雌激素受體α（estrogen receptorα，ERα）、雌激素受體β（estrogen receptorβ，ERβ）、表皮生長因子受體（epidermal

5、 growth factor receptor，EGFR）、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)、膽固醇側鏈裂解酶（cytochrome P450，family11，subfamily A,polypeptide1，CYP11A1）、芳香化酶（cytochrome P450，family19，subfamily A，polypeptide1，CYP19A1）基

6、因及蛋白表達水平。結果采用單因素方差分析。通過染毒組、治療組及對照組的相互對比，闡明中藥拮抗EEDs擬雌激素活性的作用機制。
　　結果:(1)確定爪哇猴由EEDs引致性早熟疾病模型，應以26月齡為最佳月齡，以低劑量BPA（200mg/kg）及4-NP(50mg/kg)為最佳染毒劑量，以4周為最佳染毒時間。(2)染毒組與對照組比較雌激素水平明顯升高，陰道脫落細胞成熟指數(shù)顯著增加，子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內膜上皮細胞高度、子宮腺上皮高

7、度顯著增加，子宮內膜及肌層厚度明顯增高。治療組與染毒組相比，上述指標均顯著降低(p＜0.05)。(3) RT-PCR方法檢測顯示BPA、4-NP聯(lián)合染毒可導致ERα、ERβ、EGFR、IGF-1R、CYP11A1、CYP19A1的mRNA表達水平顯著上調(p＜0.05)。而中藥干預后，可使上述基因表達顯著下調(p＜0.05)。(4)經(jīng)Western Blot方法驗證BPA、4-NP聯(lián)合染毒可導致ERα、ERβ、EGFR、CYP19A1的