環(huán)境內(nèi)分泌干擾物壬基酚快速生物檢測技術(shù)研究.pdf

1、壬基酚是已經(jīng)確認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一，且在環(huán)境中的污染狀況不容樂觀，對其進(jìn)行監(jiān)測和評估是環(huán)境監(jiān)測和治理的一項(xiàng)重要內(nèi)容。使用儀器進(jìn)行檢測雖然準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)、操作復(fù)雜、成本高。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是研究壬基酚的快速、簡便、低成本的生物檢測技術(shù)。 利用有機(jī)化學(xué)方法通過曼尼赫反應(yīng)使壬基酚酚羥基臨位上的活潑氫被羰基取代，再與載體蛋白的氨基進(jìn)行結(jié)合，制備出壬基酚.蛋白結(jié)合物。通過測定吸光度值變化并計(jì)算結(jié)合比，結(jié)果顯示壬基酚與牛血清白蛋白和卵清白

2、蛋白的結(jié)合比分別為18:1和12:1。利用得到的壬基酚-蛋白結(jié)合物制備出壬基酚多克隆抗體，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定其效價(jià)為1:78125。采用棋盤滴定實(shí)驗(yàn)確定ELISA測定樣品最適條件，對標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算檢出限(IC90)約為8ng/ml，具有較好的特異性。 通過加熱攪拌用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備納米膠體金，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描推斷其粒徑大小及均一度，經(jīng)場發(fā)射透射電鏡觀察，結(jié)果顯示膠體金粒徑約為19nm，

3、且分布比較均勻。通過最適條件的摸索，確定壬基酚多克隆抗體與膠體金進(jìn)行有效結(jié)合的最適pH為7.6，最適蛋白加入量為每毫升膠體金加入24μg抗體。根據(jù)上述條件制備免疫膠體金并對制備過程進(jìn)行監(jiān)測，經(jīng)滲濾實(shí)驗(yàn)證明結(jié)合物具有免疫活性，確認(rèn)結(jié)合成功。 經(jīng)比較實(shí)驗(yàn)，確定膠體金結(jié)合釋放墊為上海金標(biāo)生物科技有限公司型號為SBO6的玻璃膜，該膜上噴涂的免疫膠體金中壬基酚抗體濃度約為48μg/ml，層析材料為密理博(Millipore)公司型號為HF

4、Bl350220的硝酸纖維素膜，檢測線(NP-OVA)劃線濃度為0.52mg/ml，質(zhì)控線劃線濃度為羊抗兔IgG稀釋10倍。用制得的免疫層析試紙條檢測已知含有壬基酚的樣品10個(gè)，靈敏度為(4.4±2.5)μg/ml，在4℃并加入干燥劑密封的情況下儲存6個(gè)月能保持原有的檢測靈敏度不變。試紙條在10min左右出現(xiàn)清晰的條帶，檢測時(shí)間短，穩(wěn)定性良好，符合快速檢測要求，能夠?qū)崿F(xiàn)壬基酚污染事故的快速定性檢測。 本實(shí)驗(yàn)探索的ELISA法和試