高通量篩選評價典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物細胞毒性及其雌激素效應.pdf

1、隨著人類工業(yè)化進程的不斷推進,大量化學物質(zhì)在環(huán)境中不合理釋放,目前,全球已知的化學品有700萬之多,進入環(huán)境并日常接觸使用的已達數(shù)十萬余種,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和確認多種化合物屬于內(nèi)分泌干擾物。這些化學品進入環(huán)境后,可模擬或抑制內(nèi)源性激素的生物效應,改變信號傳遞過程,干擾內(nèi)源性激素的產(chǎn)生從而造成內(nèi)分泌功能紊亂。近年來,有關環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究己越來越受到各國的廣泛關注。發(fā)達國家以巨大的投入在研究環(huán)境激素的種類、污染途徑、主要污染源、生態(tài)危害、分子

2、作用機理、污染控制和防治對策方面進行了大量的工作。美國EPA和NIH于1998年8月開始實施內(nèi)分泌干擾物篩選計劃,日本環(huán)境廳發(fā)表“環(huán)境類激素戰(zhàn)略規(guī)劃公告”,于1999年正式啟動了環(huán)境類激素篩選計劃。歐洲各國普遍建立政府行為的研究中心,實施環(huán)境激素的研究計劃。據(jù)估計,發(fā)達國家在環(huán)境激素的研究方面已經(jīng)投入了數(shù)十億美元。可是由于評價體系復雜,試驗周期長,且花費巨大,還有相當一部分化合物缺少必要的環(huán)境行為和毒理學數(shù)據(jù),因此建立高通量篩選評價潛在

3、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物毒理學效應的方法已是現(xiàn)階段當務之急。
　　 在本研究中,我們進行了三方面的工作。首先通過化學光譜法高通量篩選了與遺傳信息載體DNA有相互作用的,具有潛在細胞毒性的化合物,并在免疫細胞RAW264.7和神經(jīng)細胞PC12體外細胞模型上,對其與細胞核DNA的相互作用和細胞毒性機理進行了研究;第二部分,采用了計算機分子模擬方法對一系列潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物進行了類雌激素效應的高通量篩選,同時在人工重組轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)中對雌

4、激素活性進行了高通量評價和驗證。最后我們選擇具有典型雌激素效應的手性有機氯農(nóng)藥三氯殺蟲酯,結(jié)合計算機模擬技術在兩種不同的細胞模型中對其類雌激素效應和對生殖健康潛在影響的分子機理進行了研究,結(jié)論如下:
　　 1.紫外光譜法結(jié)果顯示,功夫菊酯(lambda-cyhalothrin,λ-LCT)與小牛胸腺DNA(ctDNA)相互作用最為明顯。RAW264.7細胞毒性實驗的結(jié)果表明:λ-LCT對小鼠巨噬細胞具有顯著的細胞毒性,其細胞毒性

5、可能與λ-LCT介導的氧化應激和DNA損傷有關。
　　 2.熒光光譜法篩選了16種農(nóng)藥對DNA-EB熒光強度的影響,結(jié)果顯示聯(lián)吡啶類除草劑敵草快(diquat,DQ)能夠誘導DNA-EB體系發(fā)生熒光淬滅,因此選擇DQ作為目標化合物,對其在PC-12細胞上的細胞毒性進行評價。結(jié)果表明:DQ對PC-12細胞具有明顯的毒性,呈現(xiàn)劑量-效應關系,并可以導致細胞核染色質(zhì)凝聚。我們認為DQ與DNA通過靜電相互作用是其潛在的細胞毒性的一個可能

6、原因。
　　 3.我們通過人工重組轉(zhuǎn)基因酵母對多種菊酯類農(nóng)藥的雌激素效應的對映體選擇性進行了高通量評價,結(jié)果表明,其中三種cis-聯(lián)苯菊酯(Cis-bifenthrin,Cis-BF)、氯菊酯(Permethrin,PM)和氰戊菊酯(Fenvalerate,Fen)具有明顯的雌激素活性對映體選擇性。Cis-BF的潛在雌激素效應能力大小順序為:1S-cis-BF＞cis-BF＞1R-cis-BF。PM和Fen的外消旋體在轉(zhuǎn)基因酵母

7、系統(tǒng)中均未表現(xiàn)出明顯的雌激素效應,但它們的兩個對映體均能誘導報告基因的表達。分子對接技術為我們提供了一種有關研究手性配體與受體之間選擇性結(jié)合而引起對映體選擇的生物學差異的新方法。
　　 4.通過Molegro Virtual Docker(MVD)對接軟件篩選24種多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs),隨后運用轉(zhuǎn)入人雌激素受體α(human Estrogen receptor alpha,hE

8、Rα)基因的工程酵母進一步評價18種多氯聯(lián)苯的雌激素效應,其中15種均具有不同程度的雌激素效應。分子對接初篩結(jié)果的準確率達到了50％以上,這為今后采用基于分子對接的高通量篩選方法,對大規(guī)模數(shù)據(jù)庫化合物與靶標間的相互作用進行計算模擬奠定了基礎,可以很大程度上實現(xiàn)快速檢測確定優(yōu)先污染物的目標;同時也將有助于今后分子間相互作用的機理研究。
　　 5.我們以三氯殺蟲酯(Acetofenate,AF)為模式化合物,對其在MCF-7和JEG