霍亂弧菌腸毒素B亞單位基因在雙歧桿菌中克隆及表達(dá)的初步研究.pdf

1、研究背景： 霍亂(Cholera)是一種由霍亂弧菌(Vibriocholerae)引起的烈性傳染病，一直以來都是各國傳染病防治的重點，免疫接種是預(yù)防霍亂的最有效措施。以前的注射用疫苗不同程度存在著各種缺點，研究也顯示針對霍亂這種腸道傳染病的疫苗，通過口服途徑給予的效果優(yōu)于其他任何胃腸外給予途徑，因為腸道粘膜免疫在霍亂的免疫預(yù)防中發(fā)揮著主要作用。因此，開發(fā)安全、方便、價廉的口服疫苗成為霍亂免疫預(yù)防研究的熱點，而以霍亂弧菌腸毒素(C

2、holeratoxin，CT)為基礎(chǔ)的基因重組口服疫苗成為霍亂疫苗開發(fā)的主要方向。CT是霍亂弧菌主要的致病因子，它是分子量為84KD的腸毒素，由1個A亞單位(CholeratoxinAsubunit，CTA)和5個B亞單位(CholeratoxinBsubunit，CTB)形成的五聚體共價連接而成，CTA為毒性亞單位，CTB為無毒的受體結(jié)合亞單位，后者是霍亂的主要保護(hù)性抗原?？诜﨏TB可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性粘膜抗體和血清抗體，發(fā)揮霍亂防

3、治作用。此外，CTB還是一種很好的粘膜免疫佐劑，用于強(qiáng)化多糖、小肽等半抗原的免疫原性，與其他不相關(guān)抗原共同使用時，可以促進(jìn)誘導(dǎo)其他抗原的粘膜免疫反應(yīng)，用于更廣泛的人類疫苗的發(fā)展。所以，為充分發(fā)揮CTB的免疫特性作用，探索CTB在各種宿主表達(dá)的研究日益增多，如細(xì)菌、植物、昆蟲等。 雙歧桿菌為一種常見的益生菌，因具有多種生理功能而被廣泛地應(yīng)用于臨床、醫(yī)療、保健、食品等各個領(lǐng)域，其為腸道微生態(tài)的重要組成部分，對維持腸道微生態(tài)平衡、防治

4、腹瀉及相關(guān)疾病、保持人體健康具有重要的意義。研究顯示雙歧桿菌等乳酸細(xì)菌與霍亂腸毒素共同口服給予后，具有增強(qiáng)霍亂腸毒素產(chǎn)生的粘膜及全身免疫應(yīng)答的作用。例如，其可以產(chǎn)生乙酸及乳酸等，從而抑制腸道中致病微生物及其產(chǎn)生的有害物質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，達(dá)到促進(jìn)人體健康的作用。有研究顯示雙歧桿菌等乳酸細(xì)菌與霍亂腸毒素共同口服給予后，具有增強(qiáng)霍亂腸毒素產(chǎn)生的粘膜及全身免疫應(yīng)答的作用。 我們設(shè)想：既然霍亂口服粘膜免疫優(yōu)于其他任何免疫方式，雙歧桿菌

5、又是可以口服的益生菌，如果能夠構(gòu)建CTB重組質(zhì)粒并在雙岐桿菌中獲得表達(dá)，由雙歧桿菌攜帶CTB基因進(jìn)入腸道，定植于腸粘膜繁殖，是否可以發(fā)揮CTB及雙歧桿菌的雙重優(yōu)勢?雖然目前尚未見利用雙歧桿菌表達(dá)腸道致病菌保護(hù)性抗原的研究報道，而且對雙歧桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究也很不完善，但以往已經(jīng)有一些研究表明雙歧桿菌能表達(dá)某些外源蛋白。 目的： 本研究擬探討CTB基因是否能夠轉(zhuǎn)化雙歧桿菌并得到正確表達(dá)，鑒于目前尚沒有成熟的雙歧桿菌表達(dá)系統(tǒng)，

6、本研究擬利用大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建CTB重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，觀察CTB的表達(dá)情況。目的是為高效霍亂疫苗的研制及開發(fā)多功能益生菌活菌疫苗奠定實驗基礎(chǔ)，為CTB粘膜佐劑的應(yīng)用開辟新的路徑。 方法： (1)利用基因重組等基因工程技術(shù)，以植物表達(dá)質(zhì)粒pBI121為模板PCR擴(kuò)增CTB基因，純化回收后與pGEM-T載體連接，藍(lán)白斑篩選重組子，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-CTB，PCR、酶切等鑒定正確后送Invitrogen公司測序。

7、 (2)pGEM-CTB及大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4T-1分別用EcoRI、XhoI雙酶切后，將酶切后的目的片段純化回收后連接，CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR擴(kuò)增篩選陽性重組克隆，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-CTB。 (3)用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，酶切、測序鑒定正確后，培養(yǎng)菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE觀察表達(dá)產(chǎn)物。 (4)獲得目的表達(dá)條帶后優(yōu)化表達(dá)條件獲得最佳誘導(dǎo)時機(jī)、最佳

8、誘導(dǎo)時間、最佳誘導(dǎo)濃度等提高蛋白表達(dá)產(chǎn)量，并以兔抗CTB血清為抗體進(jìn)行Westernblotting分析，鑒定重組蛋白。 (5)用表型特征及16SrRNA的PCR方法對兩歧雙歧桿菌進(jìn)行鑒定，并獲得其對氨卞青霉素的最低抑菌濃度(MIC)，進(jìn)而將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，厭氧培養(yǎng)48～72h后，PCR篩選陽性重組克隆。 (6)酶切、測序鑒定后，同樣的方法在雙歧桿菌中表達(dá)蛋白，SDS-PAGE觀察表達(dá)產(chǎn)物條帶并用Western

9、blotting分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物。 (7)最后用雙歧桿菌轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行一周小鼠灌胃實驗，采小鼠糞便制成糞便懸液，糞便涂片觀察實驗前后腸道菌群變化，于一周后小鼠眼球采血ELISA檢測血清抗體。 結(jié)果： (1)擴(kuò)增出的CTB基因分子量約為376bp，測序結(jié)果與報道的相應(yīng)核苷酸序列比較同源性為95.8％。 (2)陽性重組克隆提取質(zhì)粒限制性酶切分析，重組質(zhì)粒EcoRI和XhoI雙酶切后可產(chǎn)生約4.9kb及376bp的

10、兩個片段，而空載體酶切后只有約4.9kb的單一片段，證明CTB片斷已正確克隆入載體，成功構(gòu)建CTB表達(dá)載體，命名為pGEX-4T-CTB。 (3)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果證明重組質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中表達(dá)37KD的霍亂弧菌腸毒素B亞單位融合蛋白。 (4)當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到A600nm為0.8、加入IPTG終濃度為0.05mmol/l、誘導(dǎo)時間為4h，表達(dá)產(chǎn)量較高，表達(dá)的重組蛋白約占菌體總蛋白的10％左

11、右。Westernblotting結(jié)果確認(rèn)了該條帶為CTB基因的產(chǎn)物，具有抗原性。 (5)對雙歧桿菌涂片鏡檢結(jié)果顯示其為革蘭氏染色陽性桿菌，16SrRNA的PCR擴(kuò)增出約560bp左右的片斷，鑒定證明該菌確為雙歧桿菌，對氨卞青霉素的MIC為4.5μg/ml。 (6)將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，SDS-PAGE結(jié)果顯示在攜帶重組質(zhì)粒pGEX-4T-CTB的雙歧桿菌全細(xì)胞蛋白中有一條相異于對照菌株的條帶產(chǎn)生，分子量約為37K

12、D，和CTB在大腸桿菌中表達(dá)的條帶位置相同，只是表達(dá)量明顯低于大腸桿菌，低于菌體總蛋白的5％，Westernblotting證實重組蛋白為CTB基因表達(dá)產(chǎn)物。 (7)轉(zhuǎn)化菌小鼠灌胃實驗一周后糞便涂片鏡檢結(jié)果顯示腸道雙歧桿菌增加，形態(tài)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化菌可以在腸道定植。小鼠眼球采血ELISA檢測，顯示一周動物實驗后血清中尚未產(chǎn)生抗體。 結(jié)論： (1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-CTB可以在大腸桿菌及雙歧桿菌中表達(dá)CT