大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位構(gòu)建表達與毒性實驗.pdf

1、第一部分：pBV220-LTB基因克隆與表達 目的：采用基因組提取方法從野生型產(chǎn)毒性大腸桿菌E．coliH44815中提取LTB基因，利用基因工程技術(shù)將其重組于表達載體pBV220，然后對含有pBV220-LTB的工程菌進行表達，蛋白質(zhì)分析，為研究該蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性提供基礎(chǔ)。 方法：用PCR方法擴增LTB目的基因片段，克隆至pBV220質(zhì)粒中，構(gòu)建pBV220-LTB的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E．coliDH5a，經(jīng)溫度誘導(dǎo)表達

2、重組蛋白。 結(jié)果：經(jīng)測序基因片段由374bp組成，為編碼124個氨基酸殘基的多肽。經(jīng)SDS-PAGE分析相對分子量(Mr)約為30000D。 結(jié)論：pBV220一LTB的原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，并在大腸桿菌DH5a中高效的表達。 第二部分：LTB蛋白質(zhì)的家兔毒性實驗 目的：LTB的粘膜免疫作用已比較明確，但是任何疫苗的開發(fā)，安全性是必須考慮的問題，重組表達載體pBV220一LTB表達蛋白有無毒性，是其能否用

3、于疫苗研究的前提，因此探討重組LTB蛋白質(zhì)對家兔的毒性作用，評價感染的可行性，為后續(xù)的雙歧桿菌研究做準(zhǔn)備，為制備治療性制劑奠定基礎(chǔ)。 方法：家兔腸袢實驗(RILT)：用3kg體重的健康家兔。禁食后麻醉剖腹后取出小腸，自回腸末段開始結(jié)扎。每段長5cm,一共四段，其中一段為陰性對照，一段為陽性對照，其余兩段注入實驗菌的腸毒素液，均為lmi；，然后將小腸放回原處，縫合腹壁。24h后剖腹取出小腸，測量各段腸液的儲存量。如每厘米>lml者