大腸桿菌不耐熱腸毒素突變蛋白的表達(dá)及其對粘膜免疫效果的影響.pdf

1、不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin，LT)是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)產(chǎn)生的六聚體型蛋白，是引起人和動物腹瀉的主要致病因子。因其具有很強(qiáng)的免疫原性以及能夠輔助其他抗原通過粘膜免疫途徑使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，而被認(rèn)為是良好的粘膜免疫佐劑，但因其具有較強(qiáng)的毒性而限制了LT在臨床上的使用。因此，制備無毒而又保留佐劑活性的LT，將其開發(fā)為優(yōu)秀的粘膜免疫佐劑，

2、有著重要的醫(yī)學(xué)價值和經(jīng)濟(jì)價值。
　　 為獲得無毒且保留佐劑活性的LT蛋白，我們以產(chǎn)腸毒素大腸桿菌S462212株為材料，根據(jù)已發(fā)表的LT基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，用重疊延伸PCR方法獲對LT的A亞單位基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功將A亞單位第63位編碼Ser的密碼子(TCT)突變?yōu)榫幋aLys的密碼子(AAA)，成功獲得突變基因LTS63K，并將其克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，在E.coliBL21中成功表達(dá)出約50KD的目

3、的蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組菌pET-LTS63K構(gòu)建成功，為研究其佐劑效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。
　　 相關(guān)研究表明，原核表達(dá)的CTLA-4胞外區(qū)具有靶向提呈抗原的功能，我們將LT突變蛋白與CTLA-4胞外區(qū)在大腸桿菌中融合表達(dá)以研究融合蛋白的免疫佐劑效應(yīng)。將研究一中構(gòu)建的LT突變基因片段，克隆入重組載體pET-CTLA-4IgV，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CTLA-LTS63K，將其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，

4、SDS-PAGE顯示出預(yù)期約60KD的蛋白條帶。Western-blotting結(jié)果顯示，突變蛋白LTS63K和融合蛋白CTLA-LTS63K均能被LT抗血清識別，證明表達(dá)的重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性。
　　 為了研究突變體蛋白LTS63K與融合蛋白CTLA-LTS63K對滅活疫苗免疫效果的影響，用獲得的蛋白溶液與禽流感滅活疫苗同時肌肉注射雛雞。將160只7日齡健康非免疫雛雞平均分為6組，第1、2組用不同劑量的LTS63K蛋白與

5、疫苗同時免疫;第3、4組用不同劑量的CTLA-LTS63K融合蛋白與疫苗同時免疫;第5組只用疫苗免疫，不加蛋白;第6組為陰性對照組，不做任何處理。于首免后每隔7天采取血清樣品和粘膜樣品，分別測定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗體水平。結(jié)果顯示，兩種蛋白對滅活疫苗的佐劑效果不明顯，與第5組檢測結(jié)果無顯著性差異。
　　 為了研究突變體蛋白LTS63K與融合蛋白CTLA-LTS63K對粘膜免疫的影響，我們用獲得的蛋白溶液作為稀釋液

6、稀釋IBDV弱毒疫苗，口服免疫雛雞，3周齡加強(qiáng)免疫一次;將240只7日齡健康非免疫雛雞平均分為8組，第1、2、3組的稀釋液中含有不同劑量的LTS63K蛋白;第4、5、6組的稀釋液中含有不同劑量的CTLA-LTS63K融合蛋白;第7組用生理鹽水作為稀釋液，不加蛋白;第8組為陰性對照組，不做任何處理。于首免后每隔7天采取血清樣品和粘膜樣品，分別測定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗體水平。結(jié)果顯示，突變蛋白及融合蛋白通過粘膜免疫途徑均能增