大腸桿菌不耐熱腸毒素突變蛋白的表達(dá)及其對粘膜免疫效果的影響.pdf

1、不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin，LT)是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)產(chǎn)生的六聚體型蛋白，是引起人和動物腹瀉的主要致病因子。因其具有很強的免疫原性以及能夠輔助其他抗原通過粘膜免疫途徑使機體產(chǎn)生特異性抗體，而被認(rèn)為是良好的粘膜免疫佐劑，但因其具有較強的毒性而限制了LT在臨床上的使用。因此，制備無毒而又保留佐劑活性的LT，將其開發(fā)為優(yōu)秀的粘膜免疫佐劑，

2、有著重要的醫(yī)學(xué)價值和經(jīng)濟(jì)價值。
　　 為獲得無毒且保留佐劑活性的LT蛋白，我們以產(chǎn)腸毒素大腸桿菌S462212株為材料，根據(jù)已發(fā)表的LT基因序列，設(shè)計了特異性引物，用重疊延伸PCR方法獲對LT的A亞單位基因進(jìn)行定點突變，成功將A亞單位第63位編碼Ser的密碼子(TCT)突變?yōu)榫幋aLys的密碼子(AAA)，成功獲得突變基因LTS63K，并將其克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，在E.coliBL21中成功表達(dá)出約50KD的目

3、的蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組菌pET-LTS63K構(gòu)建成功，為研究其佐劑效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。
　　 相關(guān)研究表明，原核表達(dá)的CTLA-4胞外區(qū)具有靶向提呈抗原的功能，我們將LT突變蛋白與CTLA-4胞外區(qū)在大腸桿菌中融合表達(dá)以研究融合蛋白的免疫佐劑效應(yīng)。將研究一中構(gòu)建的LT突變基因片段，克隆入重組載體pET-CTLA-4IgV，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CTLA-LTS63K，將其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，

4、SDS-PAGE顯示出預(yù)期約60KD的蛋白條帶。Western-blotting結(jié)果顯示，突變蛋白LTS63K和融合蛋白CTLA-LTS63K均能被LT抗血清識別，證明表達(dá)的重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性。
　　 為了研究突變體蛋白LTS63K與融合蛋白CTLA-LTS63K對滅活疫苗免疫效果的影響，用獲得的蛋白溶液與禽流感滅活疫苗同時肌肉注射雛雞。將160只7日齡健康非免疫雛雞平均分為6組，第1、2組用不同劑量的LTS63K蛋白與

5、疫苗同時免疫;第3、4組用不同劑量的CTLA-LTS63K融合蛋白與疫苗同時免疫;第5組只用疫苗免疫，不加蛋白;第6組為陰性對照組，不做任何處理。于首免后每隔7天采取血清樣品和粘膜樣品，分別測定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗體水平。結(jié)果顯示，兩種蛋白對滅活疫苗的佐劑效果不明顯，與第5組檢測結(jié)果無顯著性差異。
　　 為了研究突變體蛋白LTS63K與融合蛋白CTLA-LTS63K對粘膜免疫的影響，我們用獲得的蛋白溶液作為稀釋液

6、稀釋IBDV弱毒疫苗，口服免疫雛雞，3周齡加強免疫一次;將240只7日齡健康非免疫雛雞平均分為8組，第1、2、3組的稀釋液中含有不同劑量的LTS63K蛋白;第4、5、6組的稀釋液中含有不同劑量的CTLA-LTS63K融合蛋白;第7組用生理鹽水作為稀釋液，不加蛋白;第8組為陰性對照組，不做任何處理。于首免后每隔7天采取血清樣品和粘膜樣品，分別測定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗體水平。結(jié)果顯示，突變蛋白及融合蛋白通過粘膜免疫途徑均能增