大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構(gòu)建及其粘膜免疫劑活性的研究與B亞單位單克隆抗體的制備.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxic Escherichia coli)是一類致人和幼畜腹瀉的最常見的致病性大腸桿菌，初生幼畜感染后常見因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡，發(fā)病率和病死率均很高。大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分泌的一種不耐熱腸毒素，是引起人和家畜腹瀉的大腸桿菌的致病因子。LT是由一個具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的A亞基和具有GMl-神經(jīng)節(jié)菅脂受體結(jié)合位點的同

2、源五聚體B亞基組成的六聚蛋白。盡管LT有很強的毒性，但其同時具有很強的免疫原性并且能夠輔佐其他抗原通過粘膜免疫途徑使機體產(chǎn)生特異抗體，因而LT在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開發(fā)中具有重要醫(yī)學(xué)價值和經(jīng)濟價值。 為構(gòu)建無毒又保持粘膜免疫佐劑活性的LT突變體，進一步研究LT的免疫機理及其在基因工程疫苗研制上的應(yīng)用，本研究根據(jù)毒素的結(jié)構(gòu)及作用機理，通過基因工程的方法以不耐熱腸毒素44814株為材料，應(yīng)用PCR重疊延伸法對大腸桿菌不耐熱

3、腸毒素A亞單位進行擴增和修飾，將第63位編碼絲氨酸密碼子突變?yōu)榫幋a賴氨酸的密碼子，并用質(zhì)粒載體pGEX-6p-1在大腸桿菌BL21中進行克隆及融合表達，SDS-PAGE及Western-blot的結(jié)果分析表明獲得了LT突變體。 動物實驗將80羽1日齡非免疫健康肉雛雞隨機平均分成4組，I、II組在接種新城疫病毒LaSota株弱毒活疫苗的同時，將大腸桿菌不耐熱腸毒素A亞單位基因突變株表達產(chǎn)物作為免疫佐劑按不同劑量口服，Ⅲ組僅免疫并用

4、生理鹽水代替突變株表達產(chǎn)物，Ⅳ組為對照組，既不免疫也不口服突變株表達產(chǎn)物或生理鹽水。在免疫后的第7d、14d、21d、28d，分別測定各組動物的抗NDV血凝抑制抗體和粘膜抗體水平。結(jié)果表明，突變體對提高雞體抗NDV血凝抑制抗體效價和粘膜抗體水平均具有一定作用。 同時，本研究還利用初步提純的B亞單位的融合表達產(chǎn)物作為免疫原免疫6周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用間接ELISA檢測，經(jīng)三次亞克隆得到了穩(wěn)定