腸出血性大腸桿菌志賀毒素Ⅰ型A亞單位(Stx1A)的表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)感染是一種重要的人畜共患病，在世界各地包括發(fā)達(dá)及發(fā)展中國家都有流行，其感染具有暴發(fā)性、強烈的致病性與致死性等特點，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。EHEC感染可使人患腹瀉(Diarrhea)、出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic Colitis，HC)，還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(Hemolytic Uremic Syndrome，HUS)、

2、血栓性血小板減少性紫癜（Thromboric Thromobocytopenic Porpura，TTP）等嚴(yán)重并發(fā)癥，特別是HUS可對患者腎臟造成不可恢復(fù)性的功能損傷，病死率較高。
　　EHEC所分泌的志賀毒素（Shiga toxin，Stx）是介導(dǎo)細(xì)菌致病的重要因子，Stx可以穿越破損的腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，與其受體-丙糖?；拾贝?globotriaosylceramide，Gb3)或丁糖?；拾贝?globotetrao

3、sylceramide，Gb4)結(jié)合，造成腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官的損傷，特別是Gb3受體含量較高的腎臟，受損后易引發(fā)HUS，危及生命。因此，Stx已經(jīng)成為診斷、治療EHEC感染及其并發(fā)癥的靶向分子，本研究旨在制備StxⅠ型A亞單位(Stx1A)的單克隆抗體。
　　根據(jù)GenBank公布的Stx1A基因序列設(shè)計引物，以EHEC O157∶H7分離株基因組DNA為模板，PCR擴增出具有完整開放閱讀框架(Open Reading Fr

4、ames，ORF)Stx1A基因，序列分析表明擴增的Stx1A基因核苷酸序列與GenBank公布序列一致。將Stx1A基因經(jīng)過限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接到pET-22b(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b(+)-Stx1A，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Stx1A，重組蛋白Stx1A經(jīng)細(xì)胞破碎儀破碎后，用NiSO4親和層析柱純化、PBS透析獲得純化的重組蛋白Stx1A。SDS-PAGE

5、與蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)結(jié)果表明重組蛋白與其預(yù)期大小相符，質(zhì)譜分析結(jié)果表明該重組蛋白即為StxⅠ型A亞單位。
　　重組Stx1A蛋白與弗氏佐劑充分乳化，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）檢測、多次有限稀釋亞克隆、篩選得到能穩(wěn)定分泌抗Stx1A單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6株，分別命名為5D3-H6、10G9-D9、4