大腸桿菌不耐熱腸毒素對小鼠胚胎穩(wěn)定性的影響及分子機制的研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin,LT)是腸產(chǎn)毒大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)分泌的能導(dǎo)致動物腸炎和腹瀉的細(xì)胞毒性因子。LT由1個A亞基(LTA)和5個B亞基(LTB)組成,A亞基具有ADP核糖基化酶的活性,B亞基能與真核細(xì)胞膜GM1神經(jīng)節(jié)苷酯結(jié)合。LT除了具有很強的細(xì)胞毒性外,還具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用,可以刺激

2、機體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,是一種較強的粘膜免疫佐劑。研究發(fā)現(xiàn)由產(chǎn)毒大腸桿菌引起的腹瀉常伴隨妊娠動物的流產(chǎn),造成動物流產(chǎn)的原因除與內(nèi)毒素(LPS)對胚胎穩(wěn)定性影響外,可能還與其它致病因子有關(guān)。根據(jù)動物胚胎穩(wěn)定性依賴機體免疫平衡調(diào)節(jié)的原理和LT的免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞毒性作用,推測大腸桿菌感染性流產(chǎn)可能與LT介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致的胚胎穩(wěn)定性下降有關(guān)。為弄清LT對動物胚胎穩(wěn)定性的影響及其分子機制,本實驗利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備了重組LT蛋白(

3、包括野生型LT和脫毒突變體ITK63),用重組LT處理妊娠小鼠、巨噬細(xì)胞和體外培養(yǎng)的2-細(xì)胞胚胎,分別從LT免疫調(diào)節(jié)作用、激活炎性體作用和細(xì)胞毒性作用分析了LT對胚胎穩(wěn)定性影響。
　　 實驗結(jié)果表明,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功地制備了重組LTA和LTB及其突變體LTK63。制備的重組LT具有較強的細(xì)胞毒性作用,重組LTB具有與GM1神經(jīng)節(jié)苷酯特異結(jié)合的活性。而LTA脫毒突變體LTK63,與預(yù)期一樣缺乏細(xì)胞毒性作用。由此可見制備的重

4、組LT具有明顯的生物活性。
　　 為弄清LT對動物胚胎穩(wěn)定性和子宮胎盤組織免疫調(diào)節(jié)的影響,用重組LT處理妊娠小鼠。結(jié)果表明LT可明顯降低小鼠胚胎存活率,明顯提高小鼠子宮胎盤組織Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-2)的表達水平,而Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)的表達水平?jīng)]有明顯變化,可見LT能使Th淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子向著不利于胚胎穩(wěn)定性的Th1型細(xì)胞因子方向偏移。同時,LT可明顯提高小鼠子宮胎盤組織IL-1β的含量,表

5、明LT可激活子宮胎盤組織巨噬細(xì)胞的炎性體,后者可激活細(xì)胞Caspase1,催化細(xì)胞IL-1β前體的成熟和釋放,進而促進子宮胎盤組織的炎性反應(yīng)。組織免疫化學(xué)檢測結(jié)果顯示,LT可明顯降低子宮胎盤組織CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,小幅提高CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。上述結(jié)果表明,LT通過破壞Th1/Th2免疫平衡和激活巨噬細(xì)胞炎性體干擾胚胎的穩(wěn)定性。
　　 為進一步證實LT激活小鼠巨噬細(xì)胞的炎性體,我們用LT處理LPS致敏的小鼠巨

6、噬細(xì)胞系B6細(xì)胞,結(jié)果表明LT和脫毒突變體LTK63均可促進IL-1β的分泌,表明LT引起子宮胎盤組織IL-1β含量增加與LT激活巨噬細(xì)胞炎性體有關(guān)。通過比較LT不同亞基對炎性體的激活作用,證明只有A亞基能激活炎性體,而B亞基缺乏激活炎性體的活性。
　　 為探討LT刺激小鼠巨噬細(xì)胞炎性體的信號傳導(dǎo)途徑,我們采用NALP3(炎性體激活感受器之一)基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞系和Caspase1(酶切前體IL-1β)基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞系細(xì)

7、胞,分析LT對炎性體的激活作用,結(jié)果顯示用LT處理LPS致敏的這兩個細(xì)胞系,IL-1β分泌量均沒有明顯增加,說明LT激活巨噬細(xì)胞炎性體與NLRP3/Caspase-1信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　 為了解LT細(xì)胞毒性對小鼠胚胎發(fā)育的影響,用LT處理體外培養(yǎng)的小鼠2-細(xì)胞胚胎,結(jié)果顯示:低濃度的LT對桑椹胚和囊胚的發(fā)育沒有明顯影響,但高濃度的LT可使桑椹胚和囊胚發(fā)育提前。而LTK63對桑椹胚和囊胚的發(fā)育沒有明顯影響,說明LT的細(xì)胞毒性作

8、用可能是影響小鼠早期胚胎發(fā)育的重要因素。
　　 綜上所述,LT可明顯降低胚胎穩(wěn)定性,促進子宮胎盤組織Th1淋巴細(xì)胞因子的表達,降低CD8+T淋巴細(xì)胞在子宮胎盤組織中的數(shù)量,使Th1/Th2細(xì)胞因子和CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞向不利于胚胎穩(wěn)定性的方向偏移,LT可激活小鼠巨噬細(xì)胞炎性體,促進子宮胎盤組織IL-1β的釋放,引起組織的炎性反應(yīng),這些均為導(dǎo)致小鼠胚胎穩(wěn)定性下降的重要原因。
　　 本項研究不僅豐富了大腸桿菌性流產(chǎn)