大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的原核表達及其初步應用.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT)是分泌到細胞周質(zhì)的一種熱不穩(wěn)定腸毒素，它由A、B兩個亞單位組成，能導致旅行者和豬等家畜的嚴重腹瀉，目前還沒有預防此疾病的有效疫苗。LT不僅具有很強的黏膜免疫原性，還擁有較強的黏膜免疫佐劑效應。由于LTA的毒副作用限制了其應用，我們將無毒性的B亞單位作為研究對象。我們試圖通過制備LTB重組蛋白，研究其作為疫苗預防幼畜腹瀉的可能性，

2、并將其與減毒沙門氏菌疫苗共同免疫BALB/c小鼠，以研究其黏膜免疫佐劑效應。
　　研究目的:研究LTB作為疫苗預防幼畜腹瀉的可能性;研究LTB作為黏膜免疫佐劑對減毒沙門氏菌疫苗的佐劑效應。
　　研究方法:查閱GenBank中公布的LTB基因序列，利用軟件設(shè)計引物，PCR擴增LTB目的基因，載體質(zhì)粒pCold-TF和PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，將回收的載體和LTB片段用T4連接酶連接，構(gòu)建pCold-TF/LT

3、B重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行鑒定。將pCold-TF/LTB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，接著用IPTG進行低溫過夜誘導表達，取上清通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證后再通過His標簽親和純化，獲得可溶性蛋白TF/LTB，用ELISA對純化后的TF/LTB蛋白進行鑒定。純化的TF/LTB蛋白用來免疫BALB/c小鼠，三免后用間接ELISA法對血清和糞便的IgG和IgA水平進行檢測，并用腸毒素大腸桿菌ETEC

4、K88對免疫后的小鼠進行免疫保護實驗，用來研究LTB作為疫苗預防幼畜腹瀉的可能性。沙門氏菌減毒疫苗與純化的TF/LTB蛋白三免后同樣用間接ELISA法檢測糞便中的IgA水平，用來研究LTB的黏膜免疫佐劑效應。
　　研究結(jié)果:通過PCR成功擴增LTB基因;成功構(gòu)建pCold-TF/LTB重組質(zhì)粒;獲得TF/LTB重組蛋白;TF/LTB作為疫苗預防幼畜腹瀉有一定效果;TF/LTB對沙門氏菌減毒疫苗具有黏膜免疫佐劑效應。
　　研究