豬流感病毒模擬抗原與大腸桿菌熱敏性腸毒素B亞基融合表達(dá)及小鼠免疫試驗(yàn).pdf

1、豬流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病，一年四季均可發(fā)生，各種日齡的豬都可感染。目前對(duì)豬流感尚元有效的治療手段，臨床上主要通過疫苗接種預(yù)防該病。SI的商品化滅活疫苗主要是H1NI型和H3N2亞型單價(jià)或雙價(jià)全病毒滅活疫苗。但由于近年來重組毒株頻繁出現(xiàn)，以傳統(tǒng)流行株為毒種的滅活疫苗已無法提供理想的保護(hù)作用，因此人們開始對(duì)SIV進(jìn)行新型疫苗研究，以適應(yīng)SIV高度變異的特性。豬流感病毒(sw

2、ine influenza virus，SIV)是經(jīng)上呼吸道粘膜進(jìn)入機(jī)體引起感染的，因此黏膜免疫接種是預(yù)防SIV感染最佳免疫途徑。大腸桿菌不耐熱腸毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)B亞基具有良好的黏膜佐劑功能。 本研究利用計(jì)算模擬分析SIV主要保護(hù)性抗原蛋白血凝素(Heamagglutinin，HA)核苷酸序列，結(jié)合HA蛋白空間結(jié)構(gòu)，篩選SIV T、B抗原表位，并通過設(shè)計(jì)接頭將表位片段串聯(lián)，將該模擬表位

3、串聯(lián)于大腸桿菌熱敏性腸毒素B亞基N端，并定向克隆到原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，在融合基因下游設(shè)計(jì)了終止密碼子，以及未有終止密碼子兩種形式，分別命名為pET-30a-EL1爭pET-30a-EL2。經(jīng)測序鑒定閱讀框正確后，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)中，以1mM IPTG誘導(dǎo)，目的片段獲得成功表達(dá)。SDS-PA～GE電泳，表達(dá)重組蛋白分別為33KD和38KD，與預(yù)期大小相相符。重組蛋白大量表達(dá)，經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后，得到單一

4、的目的條帶。免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)顯示，重組蛋白可以與His-tag抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，表明表達(dá)重組蛋白為構(gòu)建的目的蛋白，蛋白命名EL1、EL2。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒分析，蛋白濃度分別為1158.88μg/mL和1245.90μg/mL。 純化后的EL1、EL2蛋白分別采用肌肉，皮下和滴鼻方式免疫8周齡KM小鼠，間隔10-15天分別進(jìn)行二免，三免。二、三免后，采血及鼻洗液，用間接ELISA檢測血清及局部粘膜抗體、血凝抑制試驗(yàn)檢測血清中抗

5、豬流感病毒抗體、T淋巴細(xì)胞增殖檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖情況。通過ELISA方陣滴定試驗(yàn)確定最佳檢測條件：血清抗體檢測，EL1蛋白包被抗原濃度1:16(62.5ng/孔)，血清樣品1：80稀釋；EL2蛋白抗原最佳包被濃度1μg/孔，血清1:160稀釋。鼻洗液樣品檢測，EL1抗原包被濃度15.6ng/孔，洗鼻液樣品1：3稀釋：EL2抗原包被濃度1μg/孔，洗鼻液樣品1：3稀釋。 三免后，血清學(xué)檢測結(jié)果：EL1肌肉免疫組、EL1皮下

6、免疫組血清IgG達(dá)較高水平，滴度達(dá)到1:10000以上；而EL1滴鼻組血清抗體水平較低；肌肉、皮下組與滴鼻組/PBS對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)，而EL1滴鼻組與PBS組無顯著性差異(P＞0.05)。EL2各免疫組血清IgG抗體與PBs組差異均極顯著(P＜0.01)。但不同免疫組之間差異也極顯著(P＜0.01)。局部粘膜分泌型IgA抗體檢測，EL1滴鼻組粘膜IgA抗體水平一直較低，與PBS組比較無顯著性差異(P＞0.05)。但EL2

7、滴鼻免疫組產(chǎn)生了較好的局部粘膜反應(yīng)，IgA水平與PBS組差異顯著(P＜0.01)。采用MTT法檢測免疫小鼠外周血T淋巴細(xì)胞增殖情況，所有免疫組均檢測到淋巴細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，差異極顯著(P＜0.01)；EL2不同處理組間也差異顯著(P＜0.01)，EL2滴鼻組T細(xì)胞增殖最明顯。HI試驗(yàn)檢測豬流感病毒血凝抗體，肌肉、皮下處理組，抗SIV H3N2亞型HI效價(jià)均達(dá)1：256以上，EL2滴鼻組的HI效價(jià)達(dá)1：32；但EL1蛋白滴鼻免疫組的