霍亂弧菌調(diào)控aphB的基因篩選及功能研究及銅綠假單胞菌對霍亂弧菌抑制作用研究.pdf

1、霍亂是一種急性腹瀉疾病，由革蘭氏陰性細菌霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起。通常是血清群O1群的古典型和埃爾托生物型霍亂弧菌致病，臨床表現(xiàn)為大量米泔樣大便，嚴重時候?qū)е虏∪水a(chǎn)生霍亂肌無力并且迅速脫水。如果迅速和適當?shù)闹委煕]有跟進，可導(dǎo)致病人死亡。
　　 毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛(the toxin-coregulated pilus，TCP)是霍亂感染中的重要毒力因子，能協(xié)助霍亂弧菌定殖于小腸?；魜y弧菌產(chǎn)生的霍亂毒素(cho

2、lera toxin，CT)則導(dǎo)致病人劇烈腹瀉。負責合成TCP的基因以操縱子的方式位于霍亂弧菌基因組中一個大毒力島上，被稱做TCP-ACF元件或霍亂毒力島(vibrio pathogenicit island，VPI)。CT毒素是由ctxA和ctxB兩個基因編碼，它們位于另一個遺傳元件原性噬菌體CTXΦ上。而位于霍亂毒力島上的ToxT是AraC型調(diào)控子，能直接激活tcp，ctxAB和其他輔助定殖因子的表達。ToxT的表達則是依賴于兩組基

3、因的合作，包括大染色體上的跨膜調(diào)控蛋白編碼基因toxRS和霍亂毒力島上的tcpPH。而AphB與AphA協(xié)同作用可以激活tcpPH的表達，同時也是導(dǎo)致兩大霍亂致病型古典型和埃爾托生物型毒力基因表達差異的原因。
　　 霍亂弧菌有三套平行的群體感應(yīng)系統(tǒng)，共同調(diào)控霍亂毒力基因表達。研究證明，霍亂弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)通過關(guān)鍵調(diào)控蛋白HapR負調(diào)控毒力基因的表達。HapR通過直接作用于aphA的啟動子區(qū)調(diào)控毒力級聯(lián)系統(tǒng)，降低毒力的表達。但是H

4、apR并不影響aphB的表達。為了研究aphB的表達調(diào)控機理，我們利用轉(zhuǎn)座子插入突變建庫的方法進行篩選。我們將aphB啟動子區(qū)克隆到兩個報告質(zhì)粒pBBRLux和pKP302上，并將其導(dǎo)入埃爾托生物型霍亂弧菌C6706(lacZ-)中，以此作為出發(fā)菌株。利用出發(fā)菌株與轉(zhuǎn)座子pSC123接合建庫，通過檢測aphB啟動子的表達水平來篩選影響aphB表達的突變株。
　　 在本研究中，我們篩選到兩株突變株T1和T2能影響aphB的表達。運

5、用隨機擴增PCR方法檢測轉(zhuǎn)座子插入位點，通過測序比對分析后發(fā)現(xiàn)T1中轉(zhuǎn)座子插入在vc1585讀碼框內(nèi)，而T2中轉(zhuǎn)座子則插入在距vc1602基因末端7bp處。通過分別構(gòu)建框內(nèi)缺失株，我們確定vc1585能夠影響aphB的表達，而vc1602及 vc1601單缺失并不影響aphB的表達。
　　 在另一個實驗中我們擬篩選能夠抑制霍亂弧菌C6706生長的細菌。經(jīng)過篩選我們發(fā)現(xiàn)了十株細菌能顯著抑制霍亂弧菌的生長。經(jīng)API20E試紙條鑒定，