霍亂弧菌CRP的碳源利用與甘露醇發(fā)酵轉(zhuǎn)錄水平的研究.pdf

1、目的：研究霍亂弧菌中CRP（cAMP receptor protein）調(diào)節(jié)蛋白、環(huán)腺苷酸受體蛋白（cAMP receptor protein CRP）對高絲氨酸脫氫（homoserine dehydrogenase isozymes, HDH）是否具有調(diào)控作用。 CRP蛋白在調(diào)節(jié)多個(gè)通路，特別是在碳源代謝中發(fā)揮重要作用，同時(shí) CRP-cAMP亦調(diào)控著霍亂弧菌甘露醇 mt l操縱子，其中mtl操縱子主要是霍亂弧菌O1群El Tor型產(chǎn)毒

2、株（主要為甘露醇慢發(fā)酵株）和非產(chǎn)毒株（主要為甘露醇快發(fā)酵株）的調(diào)控因子。研究霍亂弧菌甘露醇發(fā)酵基因mt lA、mt lD轉(zhuǎn)錄水平差別，用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)兩種類型菌株對甘露醇發(fā)酵快慢的原理。在試驗(yàn)中比較霍亂弧菌 El Tor型的產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株兩類菌株在甘露醇發(fā)酵液試驗(yàn)中操縱子基因mtA、mtlD的RNA轉(zhuǎn)錄水平差異，它是否普遍存在于不同年代和不同地區(qū)的菌株中，及其蛋白表達(dá)是否也具有相同的差異性。
　　方法：采用基因搭橋與菌株構(gòu)建的方法

3、。通過搭橋 PCR將 HDH基因啟動子中CRP潛在結(jié)合位點(diǎn)替換為 CRP保守結(jié)合位點(diǎn)，分別將替換前后的啟動子序列導(dǎo)入報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到野生珠C7258及CRP缺失株WL7258中比較冷光值的差異?；魜y弧菌中 mtl基因簇調(diào)控甘露醇發(fā)酵的結(jié)構(gòu)基因是mtlCBA，檢測不同年代與不同地區(qū)的菌株，對24株甘露醇快發(fā)酵菌株和24株甘露醇慢發(fā)酵菌株在甘露醇發(fā)酵液中提取RNA，選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0.5h，2h，4h）檢測 mtlCBA基因轉(zhuǎn)錄，用Real

4、-time熒光定量PCR的方法，比較兩類菌株中甘露醇操縱子mtA，mtlD基因轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)發(fā)酵液過程中 RNA的差異。另外，利用 WB（western）實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提取總蛋白，觀察兩類菌株mt lD基因在甘露醇發(fā)酵液中的蛋白表達(dá)差異。
　　結(jié)果：改造前報(bào)告質(zhì)粒在野生株中的冷光值高于 CRP缺失株，改造后報(bào)告質(zhì)粒的冷光值在兩株菌中均有升高，但在野生株中的升高值更為明顯。試驗(yàn)中隨機(jī)挑選24株甘露醇慢發(fā)酵株和24株甘露醇快發(fā)酵株，檢測這