基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析霍亂弧菌多重檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、1.研究背景及目的：
　　霍亂是由霍亂弧菌引起的一種急性腹瀉性傳染病，其發(fā)病急，傳染性強(qiáng)，死亡率高，是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病之一?，F(xiàn)在霍亂疫情仍然時(shí)有報(bào)道，嚴(yán)重威脅著人民群眾的健康，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)霍亂尤為重要。現(xiàn)已證實(shí)霍亂弧菌共有超過200種血清群，其中O1群與O139群為主要致病群，其他型別幾乎不會(huì)造成疾病流行。因此準(zhǔn)確檢測(cè)O1與O139群具有很大的現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)有的霍亂檢測(cè)手段或多或少都存在一些問

2、題，比如有的需要實(shí)驗(yàn)操作人員豐富的經(jīng)驗(yàn)，有的需要依靠精密的儀器設(shè)備，有的需要嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有的容易造成結(jié)果誤判，有的只能定性判斷，有的實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長，有的敏感性不是很高，有的實(shí)驗(yàn)成本較高，這些不足都抑制了霍亂弧菌臨床快速檢驗(yàn)的發(fā)展。
　　2.研究方法：
　　免疫層析作為經(jīng)典快速檢驗(yàn)技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)很短，僅使用制備完成的拭紙，直接將樣品加至樣品墊，靜置一段時(shí)間后，即可在視窗肉眼觀察結(jié)果。然而經(jīng)典的免疫層析技術(shù)過于依賴操作者

3、的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，且只能定性判斷結(jié)果，這些缺點(diǎn)都制約了免疫層析的發(fā)展。將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與免疫層析相結(jié)合，可以很大程度上避免這一問題。上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)樣品時(shí)，沒有雜光干擾，背景干凈，既保留了經(jīng)典免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便，設(shè)備輕巧，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)很少，又解決了經(jīng)典免疫層析的問題，比如結(jié)果判定依賴肉眼觀察，易造成假陽性或假陰性，不能定量判斷等，是一種具有臨床快速檢驗(yàn)前景的新技術(shù)。
　　本論文通過研究，利用基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)（Up-c

4、onverting phosphor technology-based immunochromatographic assay，UPT-ICG），采用雙抗體夾心的方法分別制備了3種拭紙—檢測(cè)小川型的9B12單抗自配拭紙；檢測(cè)霍亂O1的9F11單抗自配拭紙；檢測(cè)霍亂主要流行株的 M-（9F11+mAb2）+P-（9F11+mAb1）；還制備完成了可以檢測(cè)不同分辨度霍亂弧菌的三靶標(biāo)拭紙。三靶標(biāo)拭紙可以同時(shí)檢測(cè)霍亂弧菌O1群小川型、霍亂弧菌O

5、1群與霍亂弧菌O139群，三條檢測(cè)帶之間互不干擾，基本可以達(dá)到對(duì)霍亂弧菌主要致病群的甄別。通過對(duì)拭紙樣品墊成分優(yōu)化、結(jié)合墊抗體量與標(biāo)記條件優(yōu)化、分析膜抗體量?jī)?yōu)化，現(xiàn)在這3種單靶標(biāo)拭紙與1種三靶標(biāo)拭紙可以達(dá)到很好的敏感性、線性、精密性與特異性。經(jīng)過現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)，4種拭紙均可以達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)準(zhǔn)確率很高。
　　3.研究結(jié)果：
　　我們制備了霍亂弧菌O1群小川型單克隆抗體9B12、霍亂弧菌O1群稻葉型單克隆抗體9F11；并且利用

6、這兩種單克隆抗體，結(jié)合已有的霍亂弧菌O139群抗體mAb1與mAb2制備了三種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析的單靶標(biāo)拭紙，可以分別檢測(cè)霍亂弧菌O1群小川型、霍亂弧菌O1群與霍亂弧菌流行株—即O1群與O139群。其中檢測(cè)霍亂弧菌O1群小川型的拭紙M-9B12+P-9B12、檢測(cè)霍亂弧菌O1群的拭紙M-9F11+P-9F11的敏感性均為102cfu/ml，檢測(cè)霍亂弧菌流行株的拭紙M-（9F11+mAb2）+P-（9F11+mAb1）敏感性為103cf

7、u/ml。檢測(cè)其他食源性菌，如沙門氏菌、副溶血弧菌、致病型大腸埃希菌、李斯特菌等時(shí)，均為陰性反應(yīng)，可見這三種單靶標(biāo)拭紙具有良好的特異性。在中國疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行的臨床分離株現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，共檢測(cè)菌株78株，包括霍亂弧菌O1群小川型15株，稻葉型12株，彥島型12株（與小川型有血清凝集的共5株），O139群15株，非O1非O139群24株。針對(duì)霍亂弧菌O1群小川型的M-9B12+P-9B12檢測(cè)小川型覆蓋度為100％，檢測(cè)各型霍亂弧菌的準(zhǔn)

8、確率為98.7%。針對(duì)霍亂弧菌O1群的拭紙M-9F11+P-9F11檢測(cè)霍亂O1群的覆蓋度為100%，檢測(cè)各型霍亂的準(zhǔn)確率為100%。在三種單靶標(biāo)拭紙的基礎(chǔ)上，我們研發(fā)成功了一種可以同時(shí)檢測(cè)不同分辨度霍亂弧菌的三靶標(biāo)拭紙，在定性判斷檢測(cè)霍亂弧菌樣品的血清群、定量檢測(cè)其濃度的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行初步分型。根據(jù)出現(xiàn)峰值的T帶，判定待檢樣品是霍亂弧菌O1群小川型，或是霍亂弧菌O1群，或是霍亂弧菌O139群。這在國內(nèi)外尚屬首創(chuàng)。該三靶標(biāo)拭紙檢測(cè)霍亂

9、弧菌的敏感性可達(dá)103cfu/ml，與其他食源性菌，如沙門氏菌、副溶血弧菌、致病型大腸埃希菌、李斯特菌等無交叉反應(yīng)，特異性好，在中國疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行臨床分離株現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，其覆蓋度為100%，檢測(cè)各型霍亂的準(zhǔn)確率為100%。我們研發(fā)的4種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)的高靈敏霍亂弧菌檢測(cè)拭紙具有操作簡(jiǎn)便，儀器易攜帶，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短，可以定性定量判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，敏感性與特異性理想等優(yōu)點(diǎn)，是很有潛力的臨床快速檢驗(yàn)方法。
　　4.討論：

10、
　　在現(xiàn)有的霍亂弧菌檢測(cè)方法不能完全滿足臨床快速檢驗(yàn)的要求，存在各種各樣缺陷的情況下，基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)的拭紙研發(fā)，很大程度上可以彌補(bǔ)這一問題。使用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析拭紙檢測(cè)菌株時(shí)，僅需要使用已配制好的樣品處理液（本論文使用的是堿性蛋白胨水）稀釋樣品，然后使用加樣槍吸取樣品加至拭紙加樣孔內(nèi)，靜置15min后使用UPT生物傳感器檢測(cè)，即可獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一次實(shí)驗(yàn)操作涉及的拭紙、樣品處理液為事前制備完成的；生物傳感器體積輕