霍亂弧菌zot基因的克隆表達(dá)及其對(duì)人小腸上皮細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的：
　　用 PCR方法檢測(cè)霍亂弧菌 ctxAB和zot毒力基因，研究兩毒力基因之間的共存關(guān)系，從霍亂弧菌（ Vibrio cholera） M045中克隆小帶聯(lián)結(jié)毒素(zonula occludens toxin，zot)的全基因序列，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a(+)-zot并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)中，通過誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化重組蛋白，初步研究zot表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的凋亡作用。

2、>　　方法：
　　1、用 PCR檢測(cè)方法檢測(cè)江西省2000~2012年分離的239株霍亂弧菌中ctxAB和zot毒力基因。
　　2、采用 PCR技術(shù)從霍亂弧菌 M045中抽提基因組 DNA中擴(kuò)增出zot基因。
　　3、將zot基因克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-zot，雙酶切鑒定并DNA測(cè)序驗(yàn)證。
　　4、將重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-zot轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL

3、21(DE3)篩選表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)/ pET-32a(+)-zot，并用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)zot蛋白，利用SDS-PAGE分析蛋白產(chǎn)物。
　　5、利用親和層析柱（Ni-IDA Resin）純化表達(dá)蛋白，用Western blot對(duì)純化蛋白進(jìn)行鑒定。
　　6、將純化的zot表達(dá)蛋白作用于已貼壁生長的人小腸上皮細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1、41株 ctxAB毒力基因

4、檢測(cè)陽性的霍亂弧菌檢測(cè)zot基因?yàn)殛幮?，說明ctxAB和zot毒力基因之間不存在共存關(guān)系。
　　2、克隆出了全長約1200bp的霍亂弧菌zot基因編碼區(qū)，說明 PCR擴(kuò)增zot全基因成功。
　　3、重組質(zhì)粒雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果顯示pET-32a(+)-zot構(gòu)建成功。
　　4、SDS-PAGE分析表達(dá)菌株總蛋白顯示在與目標(biāo)蛋白大小一致的位置出現(xiàn)一條亮的條帶，說明zot蛋白表達(dá)成功。
　　5、利用親和層析柱（Ni

5、-IDA Resin）獲得純化的重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和凝膠成像系統(tǒng)分析，純化蛋白的分子量約為47kD，濃度為0.324mg/ml，經(jīng)Western blot驗(yàn)證重組蛋白為目的蛋白。
　　6、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)重組蛋白作用的人小腸上皮細(xì)胞顯示zot表達(dá)蛋白能引起人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡。
　　結(jié)論：
　　本論文成功地克隆了zot的全基因，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-zot，成功構(gòu)建了重組菌株 E.co