谷氨酰胺、甘氨酸及甘谷二肽對燒傷大鼠心肌保護作用及其信號機制的實驗研究.pdf

1、背景： 近年來研究表明，燒傷早期即可出現嚴重的心肌損害，引發(fā)心源性休克。目前亦將其稱之為“休克心”，它是燒傷最常見的并發(fā)癥之一[1,2]。由于心臟的特殊性，其損害不僅可引起心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，導致全身其它組織器官出現缺血缺氧性損害，從而引發(fā)燒傷后多器官功能不全，乃至多器官功能衰竭。因此在燒傷早期實施有效的心肌保護措施對于糾正休克，減輕臟器損害，減少內臟并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。目前臨床上對燒傷后心肌損害的治療主要以補

2、液復蘇和使用強心藥物為主，雖在一定程度上改善了心肌功能，但存在增加心肌負荷的不足，有必要尋找新的心肌保護藥物。 研究表明，谷氨酰胺(Glutamine，Gln)和甘氨酸(Glycine，Gly)對各種原因造成的心肌缺血缺氧性損害具有較好的保護作用，但谷氨酰胺溶解度低、熱穩(wěn)定性差，不能作為靜脈制劑使用，使之在危重患者中的使用受到限制。以谷氨酰胺和甘氨酸為原料合成的甘氨酰-谷氨酰胺二肽(Glycyl-glutaminedipepti

3、de，Gly-Gln，簡稱甘谷二肽)解決了這個問題。但目前尚未見甘谷二肽對心肌保護作用的報道，使用甘谷二肽是否能減輕燒傷后心肌細胞受損程度，改善心肌功能，以及谷氨酰胺和甘氨酸保護心肌細胞的機制，特別是其如何啟動心肌細胞內源性保護的信號機制還不甚清楚。 目的： 本研究通過建立原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞和大鼠燒傷損傷模型，觀察谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽對燒傷后大鼠心肌的保護效應；探討谷氨酰胺和甘氨酸啟動心肌細胞內源性保護作用的信

4、號機制。以期為甘谷二肽在燒傷臨床的應用奠定理論基礎，為燒傷患者心肌損害的救治提供新的治療手段。 一、體內實驗 方法： Wistar大鼠136只，體重200±20g，雌雄各半，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。大鼠單獨飼養(yǎng)于動物實驗室一周，保持溫度和濕度恒定，自由進食水，實驗前禁食12h。 1.動物分組和給藥方式大鼠隨機分為正常對照組(C)、燒傷對照組(B)、谷氨酰胺組(Gln)，甘氨酸組(Gly)，甘谷二肽

5、組(GG)，除C組外每組設置時相點為燒傷后12、24、48、72小時，每組每時相8只大鼠。C組不予燒傷，其余4組采用10g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉，背部電推剃毛，稱重后于剃毛區(qū)涂抹固體汽油燃燒18s，造成30％TBSAIII。燒傷(經病理切片證實)，傷后腹腔注射乳酸林格氏液(50ml/kg)抗休克。Gln組給予谷氨酰胺1.0g/kg.d，Gly組給予甘氨酸0.5g/kg.d，GG組給予甘谷二肽1.5g/kg.d。為使各組

6、大鼠等氮等熱卡，采用補充酪氨酸的方法將各組總氨基酸供給量調整為1.5g/kg.d。B、Gln和Gly組大鼠分別補充酪氨酸1.5、0.5和1.0g/kg.d。傷后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食進水。 2.檢測方法和指標燒傷后12、24、48、72小時，檢測心肌力學指標后取全血制備血清或血漿；處死大鼠迅速取心臟，切取部分組織福爾馬林液固定；取心尖處約100mg組織，提取總蛋白；剩余心肌組織液氮保存?zhèn)溆谩?(1)心肌組織HE染色，觀察

7、組織形態(tài)學變化。 (2)自動生化分析儀分析檢測血清心肌酶譜(CK、LDH、AST)的變化。 (3)大鼠左心室插管連接四導生理記錄儀，觀察心肌力學指標(AOSP、AODP、LVSP、+dp/dtmax)的變化。 (4)高效液相檢測心肌組織高能磷酸化合物(AMP、ADP和ATP)含量。 (5)分光光度法檢測心肌組織谷胱甘肽(GSH)含量和血漿乳酸(LD)含量。 (6)蛋白免疫印跡檢測心肌組織HSP70

8、含量。 (7)免疫熒光檢測心肌組織金屬硫蛋白(MT)含量。 二、體外實驗 方法： Wistar新生鼠(出生3天內)200只，雌雄不限，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。 1.原代心肌細胞培養(yǎng)和損傷模型新生鼠全身酒精消毒，剖胸迅速取心臟，切取心尖2/3，冰PBS清洗，眼科剪將組織剪碎至1～3mm3大小，采用胰酶消化分離心肌細胞，用含有10％胎牛血清和0.01MBrdu的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天待用。用含

9、10％制備的燒傷血清培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞，建立心肌細胞燒傷血清損傷模型。 2.細胞分組和檢測指標： (1)心肌細胞隨機分為對照組(C)，燒傷組(B)和給藥組(Gln組給予谷氨酰胺終濃度為12、16和20mmol/L；Gly組給予甘氨酸終濃度為0.8、1.2和1.6mmol/L)。10％燒傷血清損傷30min提取細胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡技術檢測mTOR及其下游底物P70S6k和4E-BPl的磷酸化程度。 (2)細

10、胞爬片隨機分為對照組(C)、燒傷組(B)、給藥組(Gln組谷氨酰胺終濃度為12mmol/L、Gly組甘氨酸終濃度為0.8mmol/L)和阻斷劑組(Gln+R組和Gly+R組，阻斷劑：終濃度為25ng/ml的雷帕霉素)。10％燒傷血清損傷1、3和6h，采用免疫熒光技術半定量檢測心肌細胞HSP70和MT含量及微管形態(tài)的變化。 結果： 1.燒傷后各組大鼠心肌酶譜均升高，CK、LDH于12h上升至最高，AST于24h上升至最高，

11、隨后下降；給藥組各時相酶譜上升程度明顯低于燒傷組，甘谷二肽效果優(yōu)于谷氨酰胺和甘氨酸。 2.燒傷組大鼠損傷12h后心肌間質水腫，肌纖維紊亂；24h水腫加??；48h～72h肌纖維溶解斷裂，胞核消失。使用谷氨酰胺，甘氨酸和甘谷二肽能不同程度減輕心肌病理損害。 3.燒傷后心肌力學指標(AOSP、AODP、LVSP、+dp/dtmax)均不同程度下降，72h降至最低，給藥組心肌力學指標下降幅度明顯低于燒傷對照組，甘谷二肽效果優(yōu)于谷

12、氨酰胺和甘氨酸。 4.燒傷后各組ATP、EC72h下降至最低，ADP、AMP12h升至最高；各給藥組ATP和EC明顯高于燒傷對照組，甘谷二肽效果優(yōu)于谷氨酰胺和甘氨酸。 5.燒傷后各組GSH含量72h降至最低，谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽組GSH含量明顯高于燒傷對照組，各組比較甘谷二肽組療效最明顯。 6.正常組織中含有少量MT，燒傷后MT合成有所增加，在傷后72h最高，各給藥組心肌組織MT含量明顯高于燒傷對照組；正常

13、組織中只含有微量HSP70，燒傷后HSP70含量一過性增加。各給藥組HSP70含量明顯高于燒傷對照組，各組比較甘谷二肽組療效最明顯。 7.不同濃度的谷氨酰胺和甘氨酸均能顯著增加mTOR及其下游信號分子P70S6k磷酸化程度；谷氨酰胺和甘氨酸分別在12mmol/L和0.8mmol/L時促進4E-BPl磷酸化的作用最明顯，超過該濃度促磷酸化作用有所減弱。 8.正常細胞含有微量HSP70和MT，燒傷血清損傷后其蛋白含量有所增加

14、，使用谷氨酰胺和甘氨酸能夠促進HSP70和MT蛋白合成，在孵育6h時蛋白含量最高。使用雷帕霉素能夠阻斷谷氨酰胺和甘氨酸促進HSP70和MT合成的生物效應。 9.對照組心肌細胞微管結構完整，呈網格排列，染色均勻。燒傷損傷1h微管出現斷裂，染色不均一；3h部分微管明顯缺失，6h微管結構模糊不清。谷氨酰胺和甘氨酸能明顯降低微管受損程度，使用雷帕霉素能阻斷谷氨酰胺和甘氨酸對微管的保護作用。 結論： 谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷

15、二肽能有效降低燒傷后心肌受損程度，具有很好的心肌保護作用。甘谷二肽的療效優(yōu)于谷氨酰胺和甘氨酸單獨給藥，提示谷氨酰胺和甘氨酸的保護效應具有協同作用。谷氨酰胺、甘氨酸的作用機制如下： 1.谷氨酰胺和甘氨酸能夠改善心肌能量代謝，促進ATP合成，增加細胞生物能量儲備。 2.谷氨酰胺和甘氨酸能夠促進谷胱甘肽和金屬硫蛋白合成，減少自由基生成，減輕心肌細胞脂質過氧化損害，維護細胞正常的能量代謝。 3.谷氨酰胺和甘氨酸能夠促進心