谷氨酰胺對(duì)脂多糖致大鼠心功能障礙的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　 膿毒癥早期即存在心血管功能異常,尤其是嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者,有50％存在左室收縮/舒張功能異常。關(guān)于膿毒癥繼發(fā)心功能障礙的機(jī)制復(fù)雜多樣,主要與細(xì)菌內(nèi)毒素(主要成分為脂多糖LPS)激活血管內(nèi)皮、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng),進(jìn)而激活凝血、補(bǔ)體激肽系統(tǒng)等,釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、溶酶體、一氧化氮(NO)等有關(guān),這些心肌抑制因子(MDS)可以直接損

2、傷心肌細(xì)胞,同時(shí)亦影響心肌線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝功能。此外膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞鈣循環(huán)障礙以及TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡等也促進(jìn)了心功能障礙的發(fā)生。涉及面甚廣,難以從單一環(huán)節(jié)阻斷。
　　 Toll樣受體(TLR)能夠識(shí)別病原體,并在病原體入侵機(jī)體的早期啟動(dòng)天然免疫,促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,LPS激活TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后導(dǎo)致NF-κB激活,使炎癥因子大量表達(dá),導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)和多器官功能衰竭的發(fā)生。A20作為一種NF-κB

3、依賴性表達(dá)的胞質(zhì)蛋白,對(duì)NF-κB活性有負(fù)反饋調(diào)控作用,參與了體內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)和凋亡抑制。所以通過(guò)屏蔽TLR4或下調(diào)TLR4表達(dá)以阻斷感染的源頭;同時(shí)促進(jìn)A20表達(dá),抑制LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),成為近年來(lái)防治感染繼發(fā)心功能障礙研究的熱點(diǎn)。
　　 谷胺酰胺(Glutamine,Gln)作為體內(nèi)最豐富的游離氨基酸,能夠通過(guò)誘導(dǎo)GSH合成及熱休克蛋白70表達(dá)以增強(qiáng)抗氧化物質(zhì)活性、抑制NO的產(chǎn)生,是一種多靶點(diǎn)的心肌保護(hù)藥物。因此,Gln已經(jīng)作

4、為心肌缺血再灌注損傷保護(hù)劑及危重癥患者腸粘膜免疫屏障保護(hù)劑應(yīng)用于臨床,甚至可以改善Sepsis患者的預(yù)后,證實(shí)該藥是安全可靠的。鑒于已有研究證實(shí);Gln可以下調(diào)sepsis大鼠腸道粘膜TLR4信號(hào)通路表達(dá),從而減輕腸粘膜損傷;Gln還可以減少I-κB的分解,抑制NF-κB的激活使促炎性細(xì)胞因子水平降低。簡(jiǎn)言之,Gln可以在上游TLR4表達(dá)和下游NF-κB激活雙環(huán)節(jié)抑制TLR4信號(hào)傳導(dǎo),從而減輕炎性損傷。同時(shí)戚仁斌等應(yīng)用Gln進(jìn)行大鼠離體

5、心臟主動(dòng)脈逆灌流,對(duì)LPS損傷引起的心肌細(xì)胞單相動(dòng)作電位幅度減小、MAPD及MAPD20延長(zhǎng)、心肌張力降低、心率變慢等變化有明顯的改善作用,說(shuō)明Gln對(duì)LPS所致心肌損傷有一定保護(hù)作用。因此我們通過(guò)應(yīng)用LPS血癥大鼠模型,觀察作為抗氧化、免疫營(yíng)養(yǎng)調(diào)理制劑應(yīng)用的Gln能否通過(guò)抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路,抑制LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),減輕心肌損傷及心肌凋亡而保護(hù)心功能,以期為防治感染繼發(fā)心功能障礙提供有效輔助冶療藥物。
　　 方法：

6、r>　　 1.動(dòng)物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組：健康清潔級(jí)SD大鼠90只,雄性,體質(zhì)量(350±25)g隨機(jī)分為為3組：對(duì)照組10只;生理鹽水5ml/只;LPS組40只;L,PS10mg/kg(以生理鹽水稀釋至5ml);LPS+Gln組40只;LPS10mg/kg+Gln1g/kg(以生理鹽水稀釋至5m1)腹腔注射。于注藥后6、24、48、72h處死動(dòng)物。
　　 2.腹腔注藥后6、24、48、72h后右頸總動(dòng)脈插管至左心室,RM6240

7、BD多功能生理記錄儀測(cè)定平均血壓(MAP)、左室收縮末期壓力(LVESP)、左室壓力上升及下降最大變化速率(±dp/dtmax)等心功能指標(biāo)。
　　 3.心尖組織固定、脫水、包埋,HE染色,觀察心肌病理學(xué)變化。
　　 4.RT-PCR檢測(cè)心肌TLR4、A20、TNF-αmRNA表達(dá),Western-blotting法檢測(cè)TLR4、A20、NF-κB p65蛋白表達(dá)。
　　 5.RT-PCR檢測(cè)心肌Bax、Bcl-

8、2 mRNA表達(dá),免疫組化方法測(cè)定心肌Bax、Bcl-2蛋白表達(dá);TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平;比色法測(cè)定Caspase-3活性。
　　 6.ELISA測(cè)定心肌TNF-α、血清CTnI、NT-ProBNP含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠毒血癥表現(xiàn)：大鼠注射LPS6h后即出現(xiàn)倦怠、嗜睡,進(jìn)食進(jìn)水明顯減少,呼吸急促,松毛,眼鼻血性分泌物,腹瀉,體重下降。解剖見(jiàn)心臟擴(kuò)大、雙肺淤血。
　　 2.心功能測(cè)定：

9、與對(duì)照組比較,LPS注射6h后即先后出現(xiàn)大鼠心臟+dp/dtmax、-dp/dtmax下降,且呈進(jìn)行性下降趨勢(shì),至72h回升。Gln可使不同時(shí)間點(diǎn)LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax升高(P＜0.05)。
　　 3.病理檢查：LPS組大鼠心肌細(xì)胞水腫、變性壞死,Gln治療組心肌細(xì)胞損傷減輕。
　　 5.LPS組心肌組織TLR4、A20、TNF-αmRNA及TLR4、A20、NF-κBp65蛋白表達(dá)升高,LP

10、S+Gln24h組較LPS24h組有下降趨勢(shì),差異顯著(P＜0.05)。
　　 6.LPS導(dǎo)致心肌Bel-2/Bax下降;Caspase-3活性及凋亡率明顯升高;Gln可提升心肌Bcl-2/Bax,降低Caspase-3活性及凋亡率(P＜0.05)。
　　 7.LPS組心肌TNF-α、血清CTnI、BNP濃度顯著升高,Gln能降低TNF-α、CTnI、NT-proBNP濃度,使TNF-α提前降至正常。(P＜0.05)。<