谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠燒傷后腸道的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.明確嚴(yán)重?zé)齻鸬臋C(jī)體及腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制及iNOS在其中發(fā)揮的作用;
　　2.探討谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用治療燒傷引發(fā)的腸道損傷的藥效和機(jī)制;
　　3.闡明燒傷所誘發(fā)iNOS在腸道中高表達(dá)的原因及探討谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)iNOS表達(dá)的表觀遺傳學(xué)影響。
　　材料和方法：
　　一、燒傷模型的建立、干預(yù)措施及取材
　　1.雄性Wistar大鼠110只（8周齡，140g

2、-185g），由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分組如下（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分成兩個(gè)大組）:①對(duì)照組;模型組;谷氨酰胺治療組;益生菌治療組;谷氨酰胺+益生菌治療組;②對(duì)照組;模型組;L-NAME(NOS抑制劑)組。致傷大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸以100℃沸水15s，制成20％體表面積全層皮膚燙傷模型。對(duì)照組則在大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸于25℃溫水中15s。
　　2.實(shí)驗(yàn)Ⅰ:對(duì)照組:1ml生理鹽水灌胃;模型組:致傷后1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰

3、胺治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+1ml生理鹽水灌胃;益生菌治療組:致傷后益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰胺+益生菌治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃。干預(yù)措施均為1次/d，連續(xù)7d。于傷后第7d，將各組大鼠麻醉并取腸管及血液樣本。
　　3.實(shí)驗(yàn)Ⅱ:對(duì)照組及模型組致傷后即尾靜脈注射1ml生理鹽水;L-NAME組致傷后即尾靜脈注射L-NAME HC

4、L(100mg/kg)。對(duì)照組、模型組和L-NAME組大鼠分別于傷后0、1、6，24h收集血液標(biāo)本，于傷后24h麻醉后取腸組織樣本。
　　二、生化指標(biāo)檢測(cè)
　　1.IL-6、IL-4、IL-8、TNF-α:酶聯(lián)免疫吸附法和熒光檢測(cè)法。
　　2.ROS、SOD、MDA:化學(xué)發(fā)光法。
　　3.NO:NO檢測(cè)試劑盒。
　　三、qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase ch

5、ain reaction)檢測(cè)
　　以各組大鼠腸管提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組樣本的iNOS、eNOS、nNOS、NF-κB、Bax、EGF、IL-6、TNF-α、sICAM-1、sVCAM-1、PPARγ、DNMT-1、Tet1及GADPH的mRNA表達(dá)水平。
　　四、TUNNEL檢測(cè)
　　通過(guò)TUNNEL試劑盒檢測(cè)腸道細(xì)胞凋亡情況，測(cè)100μm2凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　五、HE檢測(cè)

6、r>　　對(duì)各組大鼠的腸道樣本進(jìn)行HE染色，觀察各組大鼠腸道損傷情況。
　　六、Western blot(WB)
　　用SDS PAGE凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移各組別腸道蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉后分別孵以NF-κB、EGF、Bax、IKKB、PERK、ERK、P100、P52、DNMT-1、Tet1、iNOS、eNOS、nNOS、PPARγ和GAPDH抗體。在孵以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗后以ECL法檢測(cè)蛋白表達(dá)強(qiáng)

7、度。
　　七、甲基化特異性PCR檢測(cè)(Methylation-Specific PCR，MS-PCR)
　　DNA甲基化狀態(tài)制備基因組DNA，DNA在亞硫酸氫鹽處理后，采用DNA甲基化檢測(cè)試劑盒用引物進(jìn)行eNOS、iNOS甲基化DNA擴(kuò)增。
　　八、數(shù)據(jù)分析
　　數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：

8、　　一、燒傷可誘發(fā)機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠有效控制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的程度。
　　采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)大鼠燙傷后血液中氧化應(yīng)激的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)NO、ROS、MDA在燒傷后處于增高狀態(tài)，且SOD的活力受到嚴(yán)重抑制。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血液中IL-6、TNF-α、IL-8均增高，而IL-4降低。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠有效降低ROS、MDA、NO、TNF-a、IL-6、IL-8在血液中的含量、增高IL-

9、4含量并顯著提高SOD活力。腸組織的氧化應(yīng)急指標(biāo)及炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果顯示，除IL-4無(wú)明顯變化外，其余指標(biāo)的變化與血液中的變化趨勢(shì)相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明燒傷誘發(fā)了機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可顯著改善機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。
　　二、燒傷后NO表達(dá)水平可影響機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，iNOS通過(guò)調(diào)控NF-κB而影響腸道炎癥反應(yīng)的程度。
　　通過(guò)qRT-PCR、WB、ELISA和化學(xué)發(fā)光法

10、檢測(cè)L-NAME對(duì)燙傷大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，并明確NO在其中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)傷后血液中SOD、MDA、ROS、NO的改變要早于IL-6、TNF-α，提示燒傷引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)要先于炎癥產(chǎn)生;傷后24h腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯升高，SOD明顯降低。L-NAME組腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯降低，SOD明顯升高。通過(guò)使用NOS抑制劑L-NAME抑制燒傷引發(fā)的NO異常合成，抑

11、制了機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，證實(shí)了抑制NO可減少機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激標(biāo)志物和炎癥因子的產(chǎn)生;L-NAME組iNOS表達(dá)明顯降低，NF-κB P65表達(dá)隨之降低，提示iNOS通過(guò)NF-κB而調(diào)控炎癥反應(yīng)。
　　三、谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)燒傷后腸道損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　病理結(jié)果顯示谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能很好的修復(fù)腸道損傷，恢復(fù)腸道屏障功能。TUNNEL檢測(cè)表明聯(lián)合應(yīng)用能明顯減少腸道細(xì)胞的凋亡，WB及qR

12、T-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用抑制促凋亡相關(guān)蛋白BAX在腸道中的表達(dá)，而增高細(xì)胞修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子EGF的表達(dá)，從而減少腸道損傷并激活腸道修復(fù)。WB及qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌可有效降低腸道中iNOS的表達(dá)，其通過(guò)抑制NF-κB經(jīng)典途徑而調(diào)控炎癥和保護(hù)腸道。WB及qRT-PCR檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌能夠有效增強(qiáng)PPARγ表達(dá)，從而抑制NF-κB通路。故谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)調(diào)控iNOS的表達(dá)及對(duì)腸道的保

13、護(hù)具有重要的作用。
　　四、谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)調(diào)控iNOS基因的甲基化水平而調(diào)控iNOS表達(dá)。
　　MS-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，iNOS基因的DNA甲基化水平燒傷后出現(xiàn)降低，聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌能夠顯著提高iNOS基因的甲基化水平，而eNOS基因的DNA甲基化水平在燒傷和聯(lián)合應(yīng)用后均沒(méi)有明顯改變。WB及qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，燙傷后甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT-1)顯著降低，去甲基化酶(Tet1)顯著升高。谷氨酰胺和益生

14、菌聯(lián)合應(yīng)用后，DNMT-1的表達(dá)水平提高，而Tet1的表達(dá)水平降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠通過(guò)調(diào)控iNOS基因的甲基化水平而調(diào)控iNOS的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能通過(guò)影響DNA甲基化酶及去甲基化酶的表達(dá)，提高iNOS基因的甲基化水平，從而使NO的表達(dá)顯著降低，進(jìn)而抑制了燒傷后腸道的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減少腸道細(xì)胞凋亡，改善腸道修復(fù)功能并維護(hù)腸道的屏障功能。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能