大鼠體外循環(huán)后腸粘膜屏障功能障礙及谷氨酰胺保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、體外循環(huán)(CPB)對(duì)機(jī)體是一種全身性的強(qiáng)刺激，能引起機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激引起的過(guò)度的炎癥反應(yīng)造成組織損害、多器官功能障礙(MODS)，是心臟外科術(shù)后死亡的主要原因。CPB過(guò)程中器官保護(hù)是心血管外科基礎(chǔ)臨床研究熱點(diǎn)之一。一直以來(lái)，人們對(duì)CPB所致的心、腦、肺、腎等重要器官的研究較多，也比較深入，而其對(duì)腸屏障功能影響及其機(jī)制缺乏深入系統(tǒng)研究。腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官和重要靶器官之一。因此研究CPB過(guò)程中腸屏障損傷的發(fā)生機(jī)制及探討相應(yīng)的保護(hù)

2、措施具有極其重要的臨床意義。 本研究通過(guò)建立大鼠CPB動(dòng)物模型，對(duì)CPB的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，常規(guī)CPB組和GLN干預(yù)CPB組(簡(jiǎn)稱G組，術(shù)前3天開(kāi)始尾靜脈注射丙氨酰－谷氨酰胺溶液2ml/kg，1/日，預(yù)充液中加入2ml/kg)，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組(SH組)和正常對(duì)照組(N組)。通過(guò)放射免疫法觀察CPB后血漿中TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子水平的變化；分光光度法測(cè)定反映腸屏障功能變化的指標(biāo)如血漿D-乳酸濃度和DAO活性及腸粘膜組

3、織DAO活性；光鏡電鏡和TUNEL方法觀察CPB后IEC凋亡情況；放射免疫法、免疫組化、免疫熒光、天狼猩紅染色等方法并利用圖像分析軟件分析腸粘膜組織ECM成分改變；RT-PCR和Westernblot方法從mRNA和蛋白質(zhì)水平測(cè)定MMPs/TIMPs和HSP72的表達(dá)；明膠酶譜法反映MMPs的明膠分解活性；并且對(duì)所得結(jié)果采用SPSS11.0軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 研究主要結(jié)果如下：1.通過(guò)微型化CPB環(huán)路設(shè)備，經(jīng)右頸靜脈腔房

4、引流、左頸動(dòng)脈灌注方法成功建立建立大鼠CPB模型，轉(zhuǎn)流過(guò)程中血流動(dòng)力學(xué)、血?dú)夥治龅戎笜?biāo)均在正常范圍，術(shù)后可以長(zhǎng)期生存。 2.通過(guò)建立的大鼠CPB模型，采用病理形態(tài)學(xué)分析，超微結(jié)構(gòu)觀察，放射免疫和分光光度計(jì)的技術(shù)方法，研究腸粘膜屏障功能變化對(duì)CPB后早期全身炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1)CPB組小腸部分絨毛水腫、片狀壞死、脫落，固有層血管充血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、柱狀上皮壞死，部分絨毛斷裂、脫落。超微結(jié)構(gòu)主要表

5、現(xiàn)上皮細(xì)胞微絨毛稀疏、排列不整、呈倒伏狀、部分缺如；上皮細(xì)胞連接增寬、部分緊密連接增寬或開(kāi)放。N組和SH組明顯好于CPB組。 2)CPB后大鼠處于全身炎癥反應(yīng)狀態(tài)，與N組和SH組相比較，CPB組血漿TNF-α和IL-6濃度明顯升高(P＜0.01)；SH組血漿TNF-αα和IL-6濃度比N組也有明顯升高(P＜0.05)。 3)大鼠經(jīng)歷CPB后出現(xiàn)腸屏障功能損害。與SH和N組相比，CPB組血漿中DAO活性、D-乳酸濃度顯著升

6、高(P＜0.05)，腸粘膜組織DAO活性顯著降低(P＜0.05)。并且出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，CPB組腸靜脈血漿LPS濃度明顯升高(P＜0.05)，而對(duì)照組之間差異無(wú)顯著性(P=0.316)。 4)線性回歸及相關(guān)分析表明：血漿DAO活性、D-乳酸和LPS濃度與血漿TNF-α和IL-6濃度之間呈現(xiàn)正相關(guān)，并且與血漿DAO活性和D-乳酸濃度相關(guān)性更顯著。說(shuō)明腸屏障功能損害在CPB后全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生中起重要作用。 3.采用免疫組化、

7、免疫熒光、天狼猩紅染色、TUNEL、放免分析、RT-PCR、Westernblot和明膠酶譜法等技術(shù)方法，從IEC和ECM兩個(gè)方面在細(xì)胞和分子水平研究CPB 后腸屏障損害的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)CPB大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡明顯增加，光鏡、電鏡和TUNEL獲得了相同結(jié)果觀察，CPB組凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯升高；相關(guān)分析表明AI與血漿DAO活性、D-乳酸和LPS濃度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與腸組織DAO活性呈顯著的負(fù)相關(guān)，說(shuō)明CPB后腸上皮凋亡上調(diào)

8、是腸功能損害的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 2)小腸粘膜ECM構(gòu)成及含量明顯變化。免疫組化結(jié)果顯示CPB組層粘連蛋白(LN)和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)下降，出現(xiàn)上皮基底膜變薄，部分出現(xiàn)斷裂消失；免疫熒光顯示CPB組LN熒光強(qiáng)度降低；超微結(jié)構(gòu)觀察CPB組出現(xiàn)上皮細(xì)胞基底膜不完整甚至缺如；放射免疫定量分析顯示LN和Ⅳ型膠原含量在CPB后明顯下降，顯著低于SH組和N組(P＜0.01，P＜0.01)；天狼猩紅染色偏振光顯微鏡下膠原定性結(jié)果顯示：N組和SH組小腸

9、粘膜染色為紅黃色和綠色，即間質(zhì)性ECM中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量豐富，排列整齊；CPB組可見(jiàn)條索狀的染色明顯減少，排列紊亂交錯(cuò)，紅黃色的Ⅰ型膠原減少明顯。圖像分析結(jié)果顯示CPB組小腸組織CVF明顯減少。 3)小腸粘膜ECM變化與細(xì)胞凋亡和腸屏障功能存在相關(guān)性。線性回歸及相關(guān)分析顯示CPB后小腸粘膜LN、Ⅳ型膠原含量變化與細(xì)胞凋亡數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.568，r=-0.645，P＜0.05)。CPB后小腸粘膜LN、Ⅳ型膠原含量、CV

10、F與血漿DAO活性和D-乳酸濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。其中Ⅳ型膠原含量相關(guān)性更顯著(P＜0.01)。由此可見(jiàn)小腸粘膜ECM結(jié)構(gòu)和構(gòu)成變化可以引起IEC的失巢性凋亡，二者共同造成腸屏障功能的損害。 4)腸源性MMP-9的表達(dá)增加和激活是造成炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡和ECM變化的主要機(jī)制。RT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與N組和SH組相比較，CPB組MMP-9在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均上調(diào)(P＜0.01)，而TIMP-1的

11、表達(dá)均無(wú)明顯變化。明膠酶譜法分析表明CPB組小腸粘膜組織中MMP-2、MMP-9活性均顯著增強(qiáng)，并與MMP活性/TIMP-1變化相一致。結(jié)果提示CPB后腸粘膜ECM含量下降是通過(guò)膠原降解增加而不是合成減少來(lái)實(shí)現(xiàn)的，MMPs的激活在CPB后小腸粘膜損害和功能障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 5)MMP-9參與CPB后全身炎癥反應(yīng)。MMP-9活性和血漿TNF-α濃度直線相關(guān)分析結(jié)果提示二者存在顯著正相關(guān)(r=0.879,P＜0.05)。提

12、示MMP-9活化可能對(duì)CPB術(shù)后全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起到直接作用。 4.采用前述方法，通過(guò)觀察Ala-Gln預(yù)處理對(duì)CPB后腸損害的保護(hù)作用并探討相應(yīng)機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CPB組相比，G組大鼠腸粘膜組織形態(tài)學(xué)、腸屏障功能較有明顯改善；炎癥因子TNF-α和IL-6水平明顯降低，炎癥反應(yīng)減輕；腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)下降；ECM成分破壞減少，MMPs/TIMPs系統(tǒng)平衡狀況有所改善。應(yīng)激蛋白HSP72的表達(dá)在G組明顯高于CPB組和SH組。

13、 結(jié)論本課題在建立了大鼠CPB動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，從IEC和腸粘膜ECM兩個(gè)方面，在細(xì)胞和分子水平闡述了CPB后腸粘膜屏障功能損害的發(fā)生機(jī)制以及其與全身炎癥反應(yīng)的關(guān)系，并探討Gln預(yù)充對(duì)CPB后腸損害的保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果表明CPB術(shù)后存在腸粘膜功能損害，并且腸功能障礙在CPB術(shù)后全身炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中起重要作用。其機(jī)制主要通過(guò)三個(gè)方面：①腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡上調(diào)是腸損害的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)之一；②腸粘膜ECM的改變?cè)斐杉?xì)胞的失巢性凋亡增加

14、，并可直接造成腸屏障功能障礙；③腸源性MMPs/TIMPs平衡破壞，MMPs表達(dá)增加與活化，造成了ECM降解、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，是CPB術(shù)后腸屏障功能損害發(fā)生的重要的分子機(jī)制之一。Gln預(yù)處理可以通過(guò)誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白表達(dá)、抗凋亡和減輕炎癥反應(yīng)等途徑對(duì)CPB后腸屏障功能起到一定程度的保護(hù)作用。綜合本研究的結(jié)果我們有理由相信啟動(dòng)內(nèi)源性防衛(wèi)機(jī)制、下調(diào)細(xì)胞凋亡和調(diào)控MMPs活性有可能成為CPB過(guò)程中腸屏障功能保護(hù)、降低全身炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn)，對(duì)于降