神經(jīng)酰胺對(duì)高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PKB-eNOS信號(hào)通路的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究旨在明確:1、觀察高糖培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)酰胺及NO的濃度變化;2、神經(jīng)酰胺是否與高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素IRS-1/PI3K/PKB(Akt)/eNOS信號(hào)通路的下調(diào)有關(guān);3、抑制神經(jīng)酰胺的合成能否改善高糖引起的/PKB/eNOS的活性降低以及內(nèi)皮功能的紊亂;4、抑制神經(jīng)酰胺降解是否加重血管內(nèi)皮細(xì)胞PKB/eNOS信號(hào)通路抑制，使NO的合成減少。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組:
　　(1

2、)低濃度(5mM)和高濃度（30 mM）D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs4、8、12、16和24小時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺及NO濃度的影響;
　　(2)不同濃度5、10、20、30 mM D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞16小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺及NO濃度的變化;
　　(3)不同濃度(5、10、20、30 mM) D-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞給予50nM胰島素刺激后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NO濃度的變化;
　　(4)30mM D-葡萄糖培養(yǎng)

3、HUVECs細(xì)胞16小時(shí)，測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞上IRS-1、PI3K、Akt、eNOS蛋白表達(dá)及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化;
　　(5)分別給予神經(jīng)酰胺合成途徑的特異性抑制劑50μM Myriocin或2.μM DES后，測(cè)定30mM D-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度、Akt、eNOS蛋白表達(dá)及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化和NO的變化;
　　(6)分別給予抑制神經(jīng)酰胺降解途徑的特異性抑制劑150μMNOE或5

4、0μM PDMP后，測(cè)定30mM D-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度、Akt、eNOS蛋白表達(dá)及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化和NO的變化;
　　(7)給予30mMD-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞50nM胰島素刺激后，分別加入50μM Myriocin、2μM DES、150μM NOE或50μM PDMP，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度、Akt、eNOS蛋白表達(dá)及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化和NO的變化。
　　2

5、、方法:
　　采用高濃度D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定細(xì)胞神經(jīng)酰胺濃度;Western blot法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞中IRS-1，PI3K，Akt和eNOS表達(dá);重氮還原法測(cè)定NO合成。
　　結(jié)果:
　　1.和低糖組相比，高糖組（30mM D-葡萄糖）培養(yǎng)的HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加的趨勢(shì)，在16小時(shí)時(shí)神經(jīng)酰胺濃度達(dá)最高值，NO濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸遞減的趨勢(shì)，在24小時(shí)

6、降低最明顯;高糖組培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的濃度的升高和NO濃度減少具有時(shí)間依賴性(P＜0.05)，L-葡萄糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)酰胺濃度無顯著影響(p＞0.05)。
　　2.與低糖組相比較，10、20、30mM D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞均能引起細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度的增加和NO水平的下降(p＜0.05)，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的積聚和NO濃度下降具有濃度依賴性(p＜0.05)。
　　3.50nM胰島素培養(yǎng)HUVECs細(xì)

7、胞4、8、12、16小時(shí)，NO濃度顯著升高，在4小時(shí)NO濃度達(dá)到最高值后呈下降趨勢(shì)，24小時(shí)NO濃度降至最低。50nM胰島素刺激16小時(shí)，10mM、20 mM和30 mM D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞NO濃度均顯著下降，NO濃度與D-葡萄糖濃度成反比。
　　4.給予HUVECs細(xì)胞50nM胰島素刺激16小時(shí)后，IRS-1、PI3K、PKB、eNOS蛋白表達(dá)水平增高;與低糖組相比，高糖抑制PKB、eNOS磷酸化蛋白的表達(dá)，高糖對(duì)P

8、KB、eNOS總蛋白表達(dá)無影響(p＜0.05)。
　　5.神經(jīng)酰胺基礎(chǔ)合成阻斷劑Myriocin或DES可以阻斷高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞神經(jīng)酰胺積聚，改善高糖對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的抑制和內(nèi)皮功能的紊亂。增加PKB、 eNOS磷酸化蛋白表達(dá)，使NO的濃度升高(p＜0.05)。
　　6.神經(jīng)酰胺降解阻斷劑NOE或PDMP能使血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)酰胺濃度增加，NOE使高糖引起的PKB、eNOS磷酸化蛋白表達(dá)下降更明顯，同時(shí)降低NO的濃度(p＜0.0

9、5)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)酰胺的積聚，神經(jīng)酰胺濃度的增高具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性; L-葡萄糖對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)酰胺濃度無顯著影響;
　　2、高糖可以抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PKB/eNOS信號(hào)通路的傳導(dǎo)和引起內(nèi)皮功能的紊亂;神經(jīng)酰胺可能介導(dǎo)了高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂;
　　3、神經(jīng)酰胺合成途徑的特異性抑制劑myriocin和DES可阻斷高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血