IgA腎病患者血清IgA1對(duì)足細(xì)胞的影響及機(jī)制的探討.pdf

1、本研究的主要內(nèi)容包括： 1.IgA1對(duì)足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響及機(jī)制的探討； 2.IgA1對(duì)足細(xì)胞VEGF分泌的影響及機(jī)制的探討； 3.IgA1對(duì)足細(xì)胞合成TGF-β1和TNF-α的影響及機(jī)制的探討; 4.IgA1對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的探討； 第一章血清IgA1的提取、鑒定和細(xì)胞培養(yǎng)目的：提取IgA腎病患者和健康對(duì)照的IgA1，培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞和系膜細(xì)胞，檢測(cè)相應(yīng)受體。 方法：收

2、集符合標(biāo)準(zhǔn)的IgA腎病患者25例和健康對(duì)照15例，取其血清，采用親和層析和分子篩分離IgA1，Western—blot鑒定，取mIgA1，63℃保溫150min，轉(zhuǎn)化為IgA1(aIgA1)。小鼠足細(xì)胞MPC5和小鼠系膜細(xì)胞MSC-1097用于實(shí)驗(yàn)，免疫熒光檢測(cè)足細(xì)胞WT1的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)足細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)，步化的MSC-1097與含0.5％胎牛血清和100 ug／ml的aIgAl(分別來自IgAN患者和健康對(duì)照)RPMI 1

3、640共培養(yǎng)48小時(shí)用于制備上清。 小結(jié)：采用親和層析聯(lián)合分子篩獲得mIgA1，并經(jīng)過Western Blot鑒定，mIgA1經(jīng)熱作用后可變?yōu)榫酆闲偷腎gA1(aIgA1)；足細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，制備系膜細(xì)胞與algA1作用后的上清。 第二章 lgA腎病血清IgA1對(duì)足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響目的：探討IgA腎病患者血清aIgAl對(duì)足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響及機(jī)制。 方法：分化成熟并經(jīng)過同步化處理的足細(xì)

4、胞分別與IgA腎病來源或健康對(duì)照來源的aIgA1共培養(yǎng)稱為直接作用，而不同來源的系膜細(xì)胞上清分別與同步化的足細(xì)胞共培養(yǎng)稱為間接作用。Real-time PCR檢測(cè)Nephrin、Ang、ACE、AT1R和AR2R mRNA的表達(dá)，Western-blot檢測(cè)nephfin蛋白水平，ELISA檢測(cè)足細(xì)胞上清Ang Ⅱ的水平，透射電鏡觀察足突的變化。 小結(jié)：IgA腎病患者的aIgA1下調(diào)足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，伴有足突的融合和脫

5、落；IgA腎病患者的aIgA1與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清同樣可以下調(diào)足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，伴有足突的融合和脫落，通過足細(xì)胞腎素-血管緊張素的激活而起到作用的。 第三章IgA腎病血清lgA1對(duì)足細(xì)胞分泌VEGF的影響 目的：探討IgA腎病患者血清aIgA1對(duì)小鼠足細(xì)胞分泌VEGF的影響。 方法：實(shí)驗(yàn)分組同第三章，Real-time PCR檢測(cè)VEGF-mRNA的表達(dá)，ELISA檢測(cè)足細(xì)胞上清VEGF的水平。

6、 小結(jié)：IgA腎病患者的aIgA1可抑制足細(xì)胞VEGF的分泌；而IgA腎病患者來源的aIgA1與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清抑制足細(xì)胞VEGF的分泌，這種抑制與足細(xì)胞腎素-血管緊張素的激活無關(guān)。 第四章IgA腎病血清IgA1對(duì)足細(xì)胞TGF-β1和TNF-α影響 目的：探討IgA腎病患者血清aIgA1對(duì)小鼠足細(xì)胞分泌TGF-β1和TNF-α的影響及機(jī)制 方法：實(shí)驗(yàn)分組同第三章，Real-time PCR檢測(cè)TGF-β1-

7、mRNA的表達(dá)，ELISA檢測(cè)足細(xì)胞上清TGF-β1和TNF-α的水平。 小結(jié)：IgA腎病患者來源的aIgA1刺激足細(xì)胞TGF-β1和TNF-α的分泌；IgA腎病患者來源的algAl與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清刺激足細(xì)胞TGF-β1和TNF-α的分泌，此效應(yīng)是通過足細(xì)胞腎素．血管緊張素激活介導(dǎo)的。IgA1可通過誘導(dǎo)或加重腎臟的炎癥反應(yīng)而加速疾病的進(jìn)展。 第五章 IgA腎病血清IgA1對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制的探討 目的

8、：探討IgA腎病患者血清aIgA1對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。 方法：分化成熟并經(jīng)過同步化處理的足細(xì)胞分別與IgA腎病來源或健康對(duì)照來源的aIgA1共培養(yǎng)稱為直接作用，而不同來源的系膜細(xì)胞上清分別與同步化的足細(xì)胞共培養(yǎng)稱為間接作用。流式細(xì)胞儀和Tunel染色評(píng)價(jià)凋亡，Real-time PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、Fas、Fas-LmRNA的表達(dá)。 小結(jié)：IgA腎病的aigA1可以濃度和時(shí)間依賴的誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，F(xiàn)

9、as基因上調(diào)：而IgA腎病的aIgA1與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清同樣可誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，部分通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)而介導(dǎo)的，Bc1-2下調(diào)和Fas基因上調(diào)。 通過以上實(shí)驗(yàn)研究，我們得出以下結(jié)論： 1.小鼠足細(xì)胞表達(dá)有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)； 2.IgA腎病患者的aIgA1可下調(diào)足細(xì)胞nephrin的表達(dá)、而IgA腎病患者的aIgA1與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清可下調(diào)足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，足細(xì)胞腎素．血管緊張素系統(tǒng)

10、的激活參與其中； 3.IgA腎病患者的alga1和該aIgA1與系膜細(xì)胞培養(yǎng)的上清均可抑制足細(xì)胞VEGF的合成，此效應(yīng)與腎素-血管緊張素系統(tǒng)無關(guān)； 4.IgA腎病患者的aIgA1可刺激足細(xì)胞TGF-β1和TNF-α的合成；而IgA腎病患者的aIgA1與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清通過腎素．血管緊張素的激活而刺激足細(xì)胞TGF-β1和TNF-α的合成。 5.IgA腎病的aIgA1可以濃度和時(shí)間依賴的誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，F(xiàn)as基

11、因上調(diào)；而IgA腎病的algA1與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)的上清同樣可誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，部分通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)而介導(dǎo)的，Bc1-2下調(diào)和Fas基因上調(diào)上述研究結(jié)果提示，IgA腎病患者來源的IgA1可以通過直接或間接途徑而影響足細(xì)胞的生物學(xué)特性，表現(xiàn)為凋亡的增加、nephrin表達(dá)下調(diào)、VEGF合成減少、炎癥介質(zhì)的釋放的增加，其中自身腎素．血管緊張素系統(tǒng)的激活在間接途徑中起重要作用。上述研究有助于闡明IgA腎病中足細(xì)胞損傷機(jī)制，表明足細(xì)胞一系