proBDNF對老齡鼠認(rèn)知功能的影響及機制研究.pdf

1、研究背景： 阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是老年人群癡呆的主要類型，已經(jīng)成為危害老年人群健康和生命的重要疾病。目前全球有AD患者約1200萬人，隨著人口老齡化問題的加劇，預(yù)計到2050年全球?qū)⒐灿蠥D患者4500萬。AD的患者給家庭和社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。 我國人口老齡化問題尤為嚴(yán)峻。我國已于1999年進入老齡社會，是較早進入老齡社會的發(fā)展中國家之一，也是世界上老年人口最多的國家。21世紀(jì)

2、的中國將是一個不可逆轉(zhuǎn)的老齡社會。按目前AD的發(fā)病率推算，到2050年我國將有AD患者800萬-1200萬。AD將成為我國的一個嚴(yán)峻的經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān)，對AD的防治非常緊迫。 AD海馬的病理變化之一是海馬神經(jīng)元的缺失，研究如何防止神經(jīng)元丟失以及補充缺失的神經(jīng)元成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。近年研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物海馬齒狀回顆粒層下區(qū)終生存在著神經(jīng)發(fā)生的能力，但成年動物這種自發(fā)的神經(jīng)發(fā)生是有限的，而且隨著年齡增長逐漸下降，海馬神經(jīng)發(fā)生的

3、下降與老年認(rèn)知功能損害相關(guān)。因此，研究如何促進老齡海馬神經(jīng)元的增殖、存活及功能聯(lián)系有望為AD的防治提供新的策略。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derivedneurothrophicfactor，BDNF)通過促進細胞的增殖、分化和存活而影響神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生，BDNF還與活動依賴性突觸可塑性有關(guān)，對改善認(rèn)知功能有重要作用。BDNF由其前體物質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(precursorofbrainderivedneurotr

4、ophicfactor，proBDNF)在胞外裂解而成。最近研究表明，proBDNF是BDNF基因表達產(chǎn)物在胞外的主要存在形式之一，proBDNF與BDNF共同廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括海馬；未裂解的proBDNF本身可能有著與BDNF作用相反的功能；proBDNF第66個氨基酸位點發(fā)生變異后，BDNF分泌受限，海馬的功能受到抑制，學(xué)習(xí)記憶能力下降；病理情況下，如AD，P75NTR表達升高，proBDNF與之結(jié)合后能夠促進海馬長時程抑

5、制；老年以及AD早期動物的腦內(nèi)BDNFmRNA表達增加，proBDNF蛋白含量增加。這些研究結(jié)果提示，proBDNF在認(rèn)知功能障礙發(fā)生、發(fā)展過程中可能有著重要作用。 進一步認(rèn)識proBDNF在老齡海馬神經(jīng)發(fā)生以及突觸可塑性中的作用，對于AD的預(yù)防有重要意義。為此，本實驗的主要內(nèi)容包括：基因重組抗裂解proBDNF蛋白的表達、純化、鑒定及生物學(xué)活性測定；探討proBDNF對老齡鼠認(rèn)知功能的影響；通過體內(nèi)外實驗從海馬神經(jīng)發(fā)生及突觸可

6、塑性變化角度探討proBDNF對老齡鼠認(rèn)知功能影響的機制。 方法： 1.基因重組proBDN_F蛋白在大腸桿菌中的表達及活性鑒定 以大鼠點突變型基因的全長proBDNFcDNA為模板，用PCR方法擴增proBDNF的cDNA，應(yīng)用基因重組技術(shù)將大鼠proBDNFcDNA克隆到質(zhì)粒pET-28a中，進行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，用Ni-NTA親和層析

7、純化獲取蛋白，用SDS-PAGE和westernblot方法鑒別，DAPI法檢測重組蛋白對PC12細胞凋亡的影響。 2.proBDNF對老齡鼠認(rèn)知功能影響 實驗動物采用18月齡C57BL/6J鼠，隨機分為三組：proBDNF組、抗proBDNF組和對照組，每組10只，分別采用微量滲透泵連續(xù)6天向右側(cè)海馬注射proBDNF、羊抗proBDNF或BSA，濃度均為1μg/μ1,速度0.2μ1/h。術(shù)后21天，采用Morris水

8、迷宮進行航行定位實驗測定老齡鼠的平均逃避潛伏期、游泳速度，并進行空間探索實驗測定動物在月臺所在象限時間的百分比。 3.proBDNF對老齡鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響 實驗動物采用18月齡C57BL/6J鼠，隨機分為三組：proBDNF組，抗proBDNF組及對照組，每組lO只，分別采用微量滲透泵連續(xù)6天向右側(cè)海馬注射BSA、proBDNF或羊抗proBDNF，濃度均為1μg/μ1，速度0.2μ1/h。動物術(shù)后當(dāng)日始給予BrdU

9、50mg/kg.體重，腹腔注射，每日2次，持續(xù)6天。分別于術(shù)后7天、28天檢測海馬細胞增殖情況，并利用免疫熒光三標(biāo)法對Brdu陽性細胞進行鑒定； 4.proBDNF對老齡鼠海馬突觸可塑性的影響 實驗動物采用18月齡C57BL/6J鼠，隨機分為三組：proBDNF組，抗proBDNF組及對照組，每組5只，分別采用微量滲透泵連續(xù)6天向右側(cè)海馬注射BSA、proBDNF或羊抗proBDNF，濃度均為1μg/μ1，速度0.2μ1

10、/h。術(shù)后28天使用免疫印跡分析方法檢測海馬synapsinⅠ和pCREB的變化。 5.proBDNF對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元增殖和凋亡的影響采 用出生24小時的雌性P75NTR基因敲除鼠以及野生型鼠海馬建立海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，分別采用含proBDNF(10ng/ml)，proBDNF(10ng/ml)+sortilin-FC(20ng/ml)，或BSA(10ng/ml)的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，采用BrdU標(biāo)記法觀察海馬神經(jīng)元增

11、殖情況，用TUNEL法檢測凋亡細胞。 結(jié)果： 1.基因重組proBDNF蛋白在大腸桿菌中的表達及活性鑒定 擴增出的大鼠proBDNFcDNA片段克隆進了原核表達載體，經(jīng)酶切和核酸測序鑒定，得到了正確的重組質(zhì)粒pET-proBDNF，并在大腸桿菌中獲得了表達。純化后的蛋白經(jīng)考馬氏亮藍染色呈單一條帶，用抗proBDNF的抗體進行westernblot分析證明目的蛋白獲得了表達。免疫組化結(jié)果提示，基因重組proBDNF

12、蛋白能夠促進PC12細胞凋亡，而親合純化的羊抗proBDNF抗體能夠中和proBDNF的促細胞凋亡作用。 2.proBDNF對老齡鼠認(rèn)知功能影響 Morris水迷宮測試實驗結(jié)果顯示，從Morris水迷宮實驗第3天起，proBDNF注射組平均逃避潛伏期明顯長于對照組；而抗proBDNF組平均逃避潛伏期比對照組短。各組之間游泳速度相差不顯著。在空間探索實驗中，proBDNF組在平臺所在象限游泳時間的百分比明顯比對照組小，動物

13、入水后無目的游動，而抗proBDNF組在平臺所在象限游泳時間的百分比明顯比對照組增加，其運動軌跡主要集中于原平臺所在位置。 3.proBDNF對老齡鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響 免疫組化結(jié)果顯示，術(shù)后第7天，典型的BrdU陽性細胞內(nèi)有深棕黃色的顆粒，這些陽性細胞大部分位于顆粒細胞層與門區(qū)之間，即所謂的下顆粒區(qū)，往往緊密排列、成簇出現(xiàn)，細胞形狀不規(guī)則。術(shù)后第28天，BrdU陽性細胞呈橢圓型或圓形，形態(tài)接近顆粒細胞，多數(shù)位于顆粒細胞

14、層，也有零星細胞位于海馬門區(qū)。 術(shù)后第7天及第28天proBDNF組每張切片BrdU陽性細胞數(shù)均分別明顯低于BSA對照組(p＜0.01)，而抗proBDNF組則明顯高于BSA對照組(p＜0.01)。術(shù)后第28天，proBDNF組、抗proBDNF組及對照組，各組中BrdU陽性細胞數(shù)與術(shù)后第7天同組比較均明顯下降(其中proBDNF組下降最明顯)，分別為術(shù)后第7天的50％、38％和60％。 免疫熒光三標(biāo)法對術(shù)后第7天和第2

15、8天BrdU陽性細胞進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)proBDNF組、抗proBDNF組以及BSA組，三組中各細胞類型的百分比無顯著性差異。 4.proBDNF對老齡鼠海馬突觸可塑性的影響 術(shù)后第28天免疫印跡結(jié)果顯示，proBDNF組海馬synapsinⅠ以及pCREB的含量分別較BSA對照組明顯減少(p＜0.01)，而抗proBDNF組海馬synapsinⅠ以及pCREB的含量則明顯增加(p＜0.01)。 5.proBDN

16、F對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元增殖和凋亡的影響 對于野生型鼠培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，與對照組比較，proBDNF組BrdU陽性細胞百分比明顯降低(p＜0.01)、TUNEL陽性細胞百分比明顯增加(p＜0.01)，而proBDNF+sortilin-FC組BrdU陽性細胞百分比、TUNEL陽性細胞百分比與對照組比較無顯著差異。 P75NTR基因敲除鼠培養(yǎng)神經(jīng)元中，proBDNF組BrdU陽性細胞百分比、TUNEL陽性細胞百分比與對照組比較無

17、顯著差異。 結(jié)論： 1.本研究成功構(gòu)建了表達基因重組大鼠proBDNF的原核表達載體，基因重組大鼠proBDNF蛋白在大腸桿菌中獲得了表達和純化，所獲得的基因重組蛋白具有較好的生物學(xué)活性。 2.通過Morris水迷宮實驗，證實proBDNF能夠降低老齡鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，而阻斷內(nèi)源性proBDNF后能改善老齡鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 3.proBDNF可抑制海馬細胞增殖、降低新生細胞的存活率，但對細胞分化無影響。