IL-1對老齡小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)作為臨床手術(shù)病人術(shù)后重要的并發(fā)癥，將會(huì)嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量。術(shù)后認(rèn)知功能障礙多發(fā)生于老年患者，但是確切的機(jī)制是未知的而且圍術(shù)期眾多因素混雜其中。
　　許多研究已經(jīng)將焦點(diǎn)集中于外科手術(shù)這個(gè)初始條件。我們的實(shí)驗(yàn)室和許多研究已經(jīng)證明老年鼠手術(shù)后腦海馬區(qū)炎性反應(yīng)的刺激導(dǎo)致大量因子釋放，例如IL-1β、IL-6、TNF

2、-α等過度表達(dá)。AD病人海馬區(qū)炎性因子也被大量觀察到，而Aβ的過度表達(dá)、凝聚，更是AD患者發(fā)病機(jī)理的核心。
　　實(shí)際上有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AD病人與對照組比較細(xì)胞炎性因子水平增加。另外，AD病人大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞激活也導(dǎo)致Aβ沉積。這樣就推測POCD和AD可能存在相似的病理生理機(jī)制。早期研究已經(jīng)證明炎性因子在外科病人術(shù)后認(rèn)知下降中扮演重要角色。然而，AD病人相關(guān)路徑的分子機(jī)制和海馬區(qū)炎性因子的關(guān)系是不好理解的。以前研究已經(jīng)證明TGF-β

3、（一種在AD病人腦內(nèi)過表達(dá)的細(xì)胞因子）無論體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)均誘導(dǎo)APP堆積，促進(jìn)Aβ形成，通過Smad3信號通路激活星形膠質(zhì)細(xì)胞。但是缺乏直接的證據(jù)來證明而僅僅是推斷POCD時(shí)TGF-β/Smad信號通路可能發(fā)生重要作用。
　　本研究擬通過描述一種新的由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞炎性因子IL-17A，發(fā)現(xiàn)其在粘膜免疫、組織炎性反應(yīng)、自身免疫反應(yīng)等方面扮演的關(guān)鍵角色。我們阻斷了老年小鼠肝部分切除術(shù)后IL-17A/IL-17R來評估P

4、OCD中IL-17的作用。我們假設(shè)外科手術(shù)刺激誘導(dǎo)IL-17釋放伴隨顯著的海馬區(qū)炎癥反應(yīng)和記憶損傷。本研究的目標(biāo)有兩個(gè):一，確定IL-17觸發(fā)老年肝部分切除術(shù)小鼠海馬區(qū)炎癥反應(yīng)。二，TGF-β/Smad信號通路對這些神經(jīng)病理學(xué)和生化改變有貢獻(xiàn)。
　　材料與方法：
　　14-20月齡雄性C57BL/6小鼠，體重30-40g。飼養(yǎng)在室溫23°、濕度恒定、燈光12小時(shí)晝夜輪換房間，自由進(jìn)食及飲水。
　　實(shí)驗(yàn)一:小鼠隨機(jī)分為對

5、照組（C組），假手術(shù)組（A組）、手術(shù)組（SA組）、單克隆抗體組（SI組）、IgG組（SC組）。單克隆抗體組（SI組）和IgG組(SC組)于常規(guī)水迷宮訓(xùn)練前3天進(jìn)行側(cè)腦室置管。所有五組均在術(shù)前5天進(jìn)行常規(guī)水迷宮訓(xùn)練。對照組（C組）不作任何處理。假手術(shù)組（A組）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水，0.6％戊巴比妥鈉（50mg/kg體重）腹腔注射麻醉，不進(jìn)行手術(shù)操作。手術(shù)組（SA組）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物戊巴比妥鈉麻醉后行肝部分切除術(shù)。單克隆抗體組（SI組

6、）（肝切除術(shù)同時(shí)）側(cè)腦室注射IL-17單克隆抗體4μg。IgG組(SC組)注射兔抗鼠IgG2a（肝切除術(shù)同時(shí)）。
　　所有五組均在術(shù)后7天進(jìn)行常規(guī)水迷宮訓(xùn)練，術(shù)后1、3、7天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，時(shí)間限定90s。C組A組SA組于術(shù)后24h、72h、7d水迷宮測試后各處死小鼠，單克隆抗體組（SI組）及IgG組（SC組）術(shù)后72h水迷宮測試后處死2/3小鼠，取海馬組織，-70℃保存，等待RNA(mRNA)檢測及Western blot檢測

7、。
　　實(shí)驗(yàn)二:C57BL/6小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后將少突膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞從星形膠質(zhì)細(xì)胞中機(jī)械分離出去。免疫熒光檢測GFAP(膠原原纖維酸性蛋白)的表達(dá)鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。分為四組:
　　1）對照組，沒有干預(yù);
　　2）IL-17組，給于IL-17;
　　3）陽性對照組，給于IgG2a;
　　4)干預(yù)組，先加入IL-17RA-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h，再加入IL-17。分別于培養(yǎng)1h、

8、24h和48h收集細(xì)胞，Real-time PCR及Western blot檢測IL-17A、IL-6、TGFβ、Smad2/3、APP和Aβ的表達(dá)。
　　分為兩組，分別加入IL-17A及IL-17A+TGFβⅠ型受體選擇性抑制劑TβRI(5uM)，于培養(yǎng)24h收集細(xì)胞。Real-timePCR及Western blot檢測TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3、APP、Aβ的表達(dá)。
　　統(tǒng)計(jì)方法：
　

9、　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同組間參數(shù)分析利用t檢驗(yàn)，不同組間參數(shù)比較利用單因素或多因素方差分析，后繼Dunnett t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一:各組實(shí)驗(yàn)小鼠術(shù)前訓(xùn)練后認(rèn)知功能上升，對照組及單純麻醉組實(shí)驗(yàn)小鼠術(shù)日后認(rèn)知功能無改變。手術(shù)創(chuàng)傷組的老年小鼠術(shù)后發(fā)生認(rèn)知功能損害，以第三天為高峰，七天恢復(fù)。手術(shù)創(chuàng)傷組海馬區(qū)IL-17A

10、表達(dá)在術(shù)后第一天顯著增加，術(shù)后第三天的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP表達(dá)增多.同時(shí)，術(shù)后三天時(shí)TGF-β、Smad、APP和Aβ等表達(dá)顯著增加，維持高水平至術(shù)后第七天。IL-17單克隆抗體組的IL-17蛋白表達(dá)顯著減少，APP、pSmad蛋白表達(dá)相應(yīng)減少。
　　實(shí)驗(yàn)二:IL-17A組TGF-β、Smad1h即表達(dá)，24h達(dá)到高峰，48h小時(shí)輕微衰減。IL-17RAsiRNA組各個(gè)時(shí)點(diǎn)TGF-β、Smad表達(dá)均受抑制。IL-17A組顯著

11、上調(diào)APP、Aβ等的mRNA及蛋白表達(dá)，而IL-17RA siRNA組則相反。加入TGF-βRI組（TGF-β抑制劑）和IL-17A組比較抑制了TGF-β、pSmad、Aβ等的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1、老年C57BL/6小鼠肝部分切除術(shù)為模型觸發(fā)的一系列的神經(jīng)認(rèn)知功能下降是和IL-17誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、持續(xù)Aβ產(chǎn)生、海馬TGF-β/Smad途徑相關(guān)的。
　　2、阻斷IL-17炎癥因子或者阻斷TGF-β/Sm