硫化氫對(duì)部分肝切除小鼠術(shù)后炎癥反應(yīng)及認(rèn)知功能的影響.pdf

1、目的：術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老年人麻醉和手術(shù)后常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為麻醉手術(shù)后學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能減退,可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月,甚至可能持續(xù)存在。迄今為止,POCD確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)POCD與圍術(shù)期機(jī)體固有免疫系統(tǒng)和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活以及多種促炎因子的釋放密切相關(guān),而且有研究報(bào)道針對(duì)圍術(shù)期炎癥反應(yīng)的治療措施對(duì)POCD具有明顯的改善作用

2、。研究發(fā)現(xiàn),在多種哺乳動(dòng)物腦組織中具有相對(duì)較高濃度的內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide,H2S),且后續(xù)的研究表明內(nèi)源性H2S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均有重要的生理作用,并參與一些疾病的病理生理過(guò)程。目前這種既往被認(rèn)為具有臭雞蛋氣味的有害氣體受到了多個(gè)學(xué)科的廣泛關(guān)注,被認(rèn)為是繼一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon monoxide,CO)之后的第三種氣體信號(hào)分子。針對(duì)H2S在中樞神

3、經(jīng)系統(tǒng)作用的研究發(fā)現(xiàn),H2S能夠減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷;改善脂多糖(Iipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損害以及學(xué)習(xí)記憶功能障礙;對(duì)抗傷害性刺激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外,機(jī)體生理濃度的H2S能夠活化神經(jīng)元的ATP敏感性鉀通道,增強(qiáng)NMDA受體的活性而易化與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的海馬長(zhǎng)時(shí)程記憶增強(qiáng)(Iong-termpotentiation,LTP)形成。因此可以推斷,外源性補(bǔ)充H2S可能會(huì)對(duì)中樞

4、神經(jīng)系統(tǒng)的損害起到保護(hù)作用。我們假設(shè)術(shù)前和術(shù)后早期外源性補(bǔ)充H2S對(duì)成年小鼠手術(shù)后的認(rèn)知功能障礙具有改善作用。本實(shí)驗(yàn)擬觀(guān)察手術(shù)前和手術(shù)后早期腹腔注射硫氫化鈉(NaHS,sodium hydrosulfide(H2S的一種供體))對(duì)成年小鼠肝臟部分切除手術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙的改善作用,并進(jìn)一步探討可能涉及的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮對(duì)動(dòng)物進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)試;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Iinked Immunosorbent ass

5、ay,ELISA)檢測(cè)動(dòng)物手術(shù)后外周血促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的濃度;Western blot法檢測(cè)動(dòng)物手術(shù)后中樞海馬組織促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的表達(dá)。
　　 方法：成年雄性昆明小鼠(N=120),隨機(jī)分為5組(n=24):生理鹽水對(duì)照組(NS組),硫氫化鈉組(NaHS組),假手術(shù)組(Sham組),手術(shù)組(Surgery組)和硫氫化鈉+手術(shù)組(NaHS+surgery組)。采用Morris水迷宮

6、進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)試,過(guò)程包括術(shù)前連續(xù)5天的定位航行實(shí)驗(yàn)和在術(shù)后第1、3、7天進(jìn)行的空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。從定位航行實(shí)驗(yàn)的第3天開(kāi)始直到術(shù)后第3天,共7天,NS組、Sham組、Surgery組腹腔注射生理鹽水0.1 ml/10g·d-1,NaHS組、NariS+surgery組腹腔注射N(xiāo)aHS溶液5 mg/kg(生理鹽水稀釋,NaHS溶液濃度:50 umol/ml)。于第6天對(duì)Sham組、Surgery組及NaHS+surgery組動(dòng)物進(jìn)行手

7、術(shù)操作,動(dòng)物采用神經(jīng)安定麻醉(即:芬太尼0.2 mg/kg,氟哌利多5 mg/kg腹腔注射)待動(dòng)物反正反射消失后,固定、備皮、消毒腹部擬作切口區(qū),Sham組于腹部正中,從劍突下做一約2 cm切口,分層打開(kāi)腹腔,切口曠置5 min后經(jīng)切口處腹腔注射生理鹽水0.3 ml以補(bǔ)充手術(shù)操作過(guò)程中的液體丟失。3＃線(xiàn)逐層縫合切口,完畢后再次消毒縫合后的切口;Surgery組和NaHS+surgery組動(dòng)物麻醉方法及手術(shù)前的準(zhǔn)備同Sham組,在逐層打開(kāi)

8、動(dòng)物腹腔后,無(wú)齒鑷輕柔鉗央肝臟左外側(cè)葉拉出切口,7＃絲線(xiàn)結(jié)扎肝臟左外側(cè)葉,切除結(jié)扎外側(cè)的肝臟組織,同樣經(jīng)切口處腹腔注射生理鹽水0.3 ml補(bǔ)充手術(shù)操作期間的液體丟失,3＃絲線(xiàn)逐層縫合切口,縫合完畢后再次消毒縫合后的切口。動(dòng)物手術(shù)后單獨(dú)飼養(yǎng),注意保暖,觀(guān)察動(dòng)物手術(shù)切口處有無(wú)出血等異常情況,待麻醉蘇醒、自主活動(dòng)恢復(fù)后再次按術(shù)前的分組進(jìn)行飼養(yǎng)。于術(shù)后第l、3、7天分別從各組中抽取8只動(dòng)物進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),測(cè)試環(huán)境同定位航行實(shí)驗(yàn)。測(cè)試完畢后,動(dòng)

9、物麻醉狀態(tài)下,經(jīng)眼眶采血后處死,迅速取出腦組織,分離海馬,立刻置于液氮中,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中,保存?zhèn)溆谩＝?jīng)眼眶采取的外周血,室溫靜置2 h后,3000 g,4℃離心5 min,取上層血清于EP管中,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELJSA檢測(cè)動(dòng)物手術(shù)后外周血TNF-a、IL-Iβ、IL-6濃度;Western blot法檢測(cè)動(dòng)物手術(shù)后海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達(dá),
　　 結(jié)果：⑴動(dòng)物Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。術(shù)前定

10、位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)過(guò)連續(xù)5天的定位航行訓(xùn)練,各組的逃避潛伏期以及潛伏期內(nèi)游泳總路程隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加而逐漸縮短,但同一時(shí)間點(diǎn)上述兩指標(biāo)組間的比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),定位航行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,各組動(dòng)物的游泳速度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后空間探索實(shí)驗(yàn):術(shù)后第1、3、7天,同一時(shí)間點(diǎn)各組動(dòng)物游泳速度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后第1天,與NS組比較,NaHS組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、穿臺(tái)次數(shù)無(wú)明顯變

11、化,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),Sham組、Surgery組、NaHS+surgery組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、穿臺(tái)次數(shù)較NS組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);與Surgery組比較,Sham組、NaHS+surgery組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比及穿臺(tái)次數(shù)較Surgery組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。術(shù)后第3天,與NS組比較,NaHS組、Sham組、NaHS+surgery組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、穿臺(tái)次數(shù),差異

12、均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),Surgery組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、穿臺(tái)次數(shù)低于NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。術(shù)后第7天,Surgery組目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、穿臺(tái)次數(shù)仍低于NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),但NS組、NaHS組、Sham組和NaHS+surgery組,上述兩指標(biāo)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。⑵ELISA～檢測(cè)動(dòng)物手術(shù)后血清促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的濃度。與NS組比較,N

13、aHS組術(shù)后第1、3、7天,血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度未見(jiàn)明顯變化,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);術(shù)后第1天,與NS組比較,Sham組、Surgery組、NaHS+surgery組血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度較NS組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);但Sham組及NaHS+surgery組血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度低于Surgery組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);術(shù)后第3天,NS

14、組、NaHS組、Sham組和NaHS+surgery組,四組間血清IL-1β、IL-6濃度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),但Surgery組血清IL-1β、IL-6濃度高于NS組和Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而血清TNF-a濃度四組間的比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);術(shù)后第7天時(shí),各組間血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。⑶Western blot檢測(cè)動(dòng)物術(shù)

15、后海馬組織促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6表達(dá)。術(shù)后第1天,與NS組比較,NaHS組、Sham組及NaHS+surgery海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達(dá)未見(jiàn)明顯升高,各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),Surgery組術(shù)后第1天,海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達(dá)水平較其余四組組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);術(shù)后第3天,與NS組比較,NaHS組、Sham組和NaHS+surgery組海馬組

16、織TNF-a表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),但Surgery組海馬組織IL-1β、IL-6表達(dá)仍高于NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);術(shù)后第7天,各組海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達(dá)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：①對(duì)于成年小鼠,手術(shù)創(chuàng)傷能夠引起術(shù)后早期的認(rèn)知功能障礙;圍術(shù)期激活的外周和中樞炎癥反應(yīng)可能參與術(shù)后認(rèn)知功能障礙形成。②術(shù)前和術(shù)后早期腹腔注射硫化氫能夠改善肝臟部分切除小