白介素22融合蛋白對伴有基礎(chǔ)肝損傷小鼠部分肝切除術(shù)后肝再生的影響.pdf

1、背景原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)仍被認(rèn)為是目前最為有效的治療手段。肝臟再生不足和缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury, IRI）是部分肝臟切除手術(shù)（Partial hepatectomy, PHx）術(shù)后面臨的兩大難題，多數(shù)患者由于伴有基礎(chǔ)肝臟疾病或病變范圍過大，如若手術(shù)，則術(shù)后極有可能因?yàn)楦闻K再生不足而誘發(fā)急性肝衰竭，造成病

2、人死亡。盡管白細(xì)胞介素22（Interleukin22, IL-22）對于肝臟的保護(hù)作用及對正常小鼠單純PHx術(shù)后肝臟再生的促進(jìn)作用已被發(fā)現(xiàn)，目前仍缺少IL-22對伴有基礎(chǔ)肝病的小鼠PHx術(shù)后肝臟再生作用的研究數(shù)據(jù)。另外，之前的研究者所使用的IL-22多為常規(guī)重組人白介素22蛋白（Recombinant human interleukin22, rh-IL-22）,而對于作用時間更長、分子量更大的白介素22融合蛋白（Interleuki

3、n22 fusion protein, IL-22-FP）對肝臟保護(hù)及肝再生作用的研究甚少。為了更加真實(shí)的模擬臨床病人的實(shí)際情況，進(jìn)一步研究IL-22-FP對肝臟再生的作用，設(shè)計(jì)了本論文實(shí)驗(yàn)，探討IL-22-FP對伴有基礎(chǔ)肝病的小鼠PHx術(shù)后肝臟的保護(hù)作用及肝再生的促進(jìn)作用，同時探究IL-22-FP對小鼠肝臟缺血再灌注（IR）損傷的保護(hù)作用，為擴(kuò)大PHx手術(shù)適應(yīng)癥，減少手術(shù)患者術(shù)后死亡率提供數(shù)據(jù)支持。
　　目的：研究IL-22-F

4、P對伴有基礎(chǔ)肝病小鼠PHx術(shù)后肝臟的保護(hù)及肝再生的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）、四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）等化學(xué)物質(zhì)制造小鼠基礎(chǔ)肝損傷模型，在此基礎(chǔ)上行2/3PHx手術(shù)，術(shù)前30min靜脈給予IL-22-FP（125μg/kg）或者等量對照（PBS）治療。ConA模型小鼠隨機(jī)分為以下幾組：1.單一ConA損傷組：ConA組；2

5、.單一PHx手術(shù)組：PHx組；3.ConA損傷加PHx手術(shù)組：ConA+PHx組；4.ConA損傷加PHx手術(shù)加IL-22-FP治療組：ConA+PHx+IL-22-FP組。CCl4模型小鼠同樣的方法分為以下4組：1.CCl4組(單一CCl4損傷組)；2.PHx組(單一PHx手術(shù)組)；3.CCl4+PHx組(CCl4損傷加PHx手術(shù)組)；4.CCl4+PHx+IL-22-FP組(CCl4損傷加PHx手術(shù)加IL-22-FP治療組)。術(shù)后不

6、同時間點(diǎn)（32h,40h,48h,1w）過量麻醉法處死小鼠，獲取小鼠血清和肝臟組織用于后續(xù)研究。
　　2.通過阻斷小鼠部分肝葉血流（70%），90 min后恢復(fù)血流，制造小鼠肝臟IRI模型，術(shù)前30min靜脈給予IL-22-FP（125μg/kg）或者等量對照（PBS）治療，再灌注后不同時間點(diǎn)（6h,24h,48h）處死小鼠，獲取血清和肝臟組織樣本。IRI模型小鼠隨機(jī)分為4組，分別為：1.假手術(shù)組：Sham組；2.單一IRI手術(shù)組

7、：IRI組；3.IRI手術(shù)加普通白介素22(rh-IL-22)治療組：IRI+rh-IL-22組；4.IRI手術(shù)加白介素22融合蛋白治療組：IRI+IL-22-FP組。
　　3.應(yīng)用全自動生化分析儀測定小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，作為衡量肝臟損傷程度的指標(biāo)之一。
　　4.取出固定于10%甲醛溶液中的部分小鼠肝臟組織，用于5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2,-deoxyuridine，BrdU

8、）染色。染色陽性細(xì)胞即為增殖的肝細(xì)胞，通過計(jì)算BrdU陽性率（BrdU+肝細(xì)胞數(shù)/肝細(xì)胞總數(shù)）來比較不同組別小鼠肝臟再生的水平。
　　5.部分肝組織樣本用于蘇木精-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色。通過染色，觀察肝臟組織壞死范圍、程度及炎性細(xì)胞浸潤情況，用以反應(yīng)肝臟損傷的程度。
　　6.應(yīng)用蛋白免疫印記技術(shù)（Western blot，WB）定量檢測不同組別小鼠肝臟組織中與肝臟再生相關(guān)蛋白如增殖細(xì)胞

9、核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白(CyclinB1，CyclinD1)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3（Signal transducer and activator of transcription，STAT3）和p-STAT3蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.在ConA模型中，低劑量（42μg/kg, Low dose group）IL-22-FP治療組小鼠比中（125μg/kg, Middle dose group）、高

10、（375μg/kg, High dose group）劑量IL-22-FP治療組小鼠肝組織損傷更嚴(yán)重，血清ALT水平更高，BrdU陽性率更低。而中、高劑量組之間的這些差異并不明顯。
　　2. IL-22-FP能夠有效減輕ConA誘導(dǎo)的小鼠肝組織損傷，促進(jìn)ConA模型小鼠PHx后的肝再生，其機(jī)制可能與激活的p-STAT3及誘導(dǎo)的PCNA、CyclinD1蛋白的表達(dá)有關(guān)
　　同常規(guī)重組IL-22治療組及其他手術(shù)組相比，IL-22

11、-FP治療組在PHx術(shù)后血清ALT及AST水平均顯著降低，炎癥細(xì)胞浸潤及肝組織壞死程度明顯減輕。術(shù)后不同時間點(diǎn)IL-22-FP治療組肝指數(shù)（肝臟重量/體重，LW/BW）及BrdU陽性率均明顯高于其他未治療組和常規(guī)重組IL-22治療組。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后32h同其他組相比，IL-22-FP治療組小鼠肝組織p-STAT3、PCNA及CyclinD1蛋白的表達(dá)量也明顯升高。
　　3. IL-22-FP能夠顯著減輕CCl4導(dǎo)致的肝損傷，促

12、進(jìn)CCl4模型小鼠PHx術(shù)后的肝再生，并誘導(dǎo)肝組織中p-STAT3、CyclinB1、CyclinD1及PCNA蛋白的表達(dá)
　　肝指數(shù)結(jié)果可見，術(shù)后32、40及48h，IL-22治療組小鼠肝指數(shù)水平明顯高于其他組；與肝指數(shù)類似的是，術(shù)后32、40及48h IL-22-FP治療組BrdU陽性率也顯著高于其他組，而術(shù)后1w時，各組均很難見到染色陽性細(xì)胞。WB結(jié)果顯示，IL-22-FP治療組術(shù)后肝臟組織p-STAT3、PCNA、Cycl

13、inD1及CyclinB1等蛋白表達(dá)量明顯多于其他未治療組，差異顯著。
　　4. IL-22FP能夠有效保護(hù)肝臟，顯著減輕肝臟缺血再灌注損傷
　　在IRI小鼠模型中，IL-22-FP治療組同rh-IL-22治療組及其他手術(shù)組相比在再灌注后24及48h血清AST水平顯著降低；HE染色切片可以看到在再灌注后48h IL-22-FP治療組小鼠肝組織缺血壞死范圍也較其他組更小。
　　結(jié)論：
　　1. IL-22-FP能夠