硫化氫對急性心肌缺血損傷的影響.pdf

1、心血管疾病是威脅人類生命健康的重大疾病，隨著社會進(jìn)步和人民生活水平提高，其發(fā)病率逐年增長。而心肌缺血性疾病又是心血管疾病中的焦點，并可發(fā)展為心律失常、心肌梗死。因而如何切實有效地減輕因心肌缺血引起的損傷已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界面臨的一個熱點問題。冠脈結(jié)扎法是最常用的建立急性心肌缺血模型的方法，廣泛應(yīng)用于心肌缺血損傷機制的研究。Langendorff離體心臟灌注穩(wěn)定性好，重復(fù)性強，操作方便，是心血管研究領(lǐng)域中最為廣泛使用的實驗?zāi)Ｐ椭??？梢詥为殞?/p>

2、心臟進(jìn)行研究，也排除了神經(jīng)體液系統(tǒng)對實驗過程的干擾。
　　 20世紀(jì)90年代，繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)了第三種氣體信號分子硫化氫(hydrogensulfide，H2S)。內(nèi)源性H2S在哺乳動物組織中廣泛存在，參與了重要的生理和病理過程，且與多種心血管疾病有關(guān)。研究表明，H2S可拮抗心肌缺血再灌注損傷，具有心血管保護(hù)效應(yīng)。但對急性心肌缺血損傷的影響報道較少，其機制尚不明確。本研究采用冠脈結(jié)扎法及Langend

3、orff灌流系統(tǒng)復(fù)制離體大鼠急性心肌缺血損傷模型，觀察H2S對急性心肌缺血損傷的影響，并從炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等方面探討其可能的作用機制。
　　 第一部分:離體急性缺血心肌內(nèi)源性硫化氫和胱硫醚-γ-裂解酶的變化
　　 目的:觀察急性心肌缺血過程中不同時間內(nèi)源性H2S和CSE的變化。
　　 方法:應(yīng)用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立急性心肌缺血損傷模型。健康雄性SD大鼠160只，體質(zhì)量(270

4、±20g)，隨機分為假手術(shù)組，缺血30min組，缺血1h組，缺血2h組，缺血3h組，缺血4h組。假手術(shù)組80只（每個時間點16只），其余每組16只。缺血組結(jié)扎左冠狀動脈前降支，假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎。分別于術(shù)后30min、1h、2h、3h、4h取材。取材前應(yīng)用Powerlab/8s多導(dǎo)生理儀記錄各組大鼠左室發(fā)展壓(LVDP)、左室壓力變化速率(±dp/dtmax);測定冠脈流量(CF);檢測心肌組織中H2S含量及CSE活性;以Evan'

5、s藍(lán)和TTC雙染法檢測心肌梗死體積。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組間血流動力學(xué)指標(biāo)在灌流平衡期間無明顯差異，與相應(yīng)假手術(shù)組大鼠比較，缺血30min、1h、2h、3h、4h組大鼠LVDP、±dp/dtmax、CF明顯降低(P＜0.01）。
　　 2.假手術(shù)組大鼠心肌組織中H2S含量和CSE活性在灌流平衡后30min～4h之間無明顯變化。與相應(yīng)假手術(shù)組大鼠比較，缺血30min時大鼠心肌組織中H2S含量和CSE活性無明

6、顯變化，但隨著缺血時間的延長，缺血1h、2h、3h、4h組大鼠心肌組織H2S含量和CSE活性均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3.與相應(yīng)假手術(shù)組大鼠比較，缺血30min時大鼠心肌組織無明顯梗死灶，缺血1h時可見明顯梗死灶(P＜0.01)，隨著缺血時間的延長，缺血2h、3h、4h時梗死體積明顯增大(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:心肌缺血2h后，隨缺血時間延長，心肌組織中H2S含量和CSE活性明顯降低，心肌組

7、織梗死體積逐漸增大，提示H2S與CSE參與了離體大鼠急性心肌缺血損傷。
　　 第二部分:硫化氫對離體急性缺血損傷大鼠心肌的影響
　　 目的:觀察H2S對急性心肌缺血損傷大鼠心臟功能，心肌組織H2S/CSE及心肌梗死體積的影響。
　　 方法:應(yīng)用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立急性心肌缺血損傷模型。健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(270±20g)，隨機分為假手術(shù)組，模型組，硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑

8、量組，每組16只。模型組結(jié)扎左冠狀動脈前降支。假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎。硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組分別于心肌急性缺血2h時更換為5μmol/L，10μmol/L,20μmol/L的NaHS灌流液。分別于缺血后4h取材。取材前應(yīng)用Powerlab/8s多導(dǎo)生理儀記錄各組大鼠左室發(fā)展壓(LVDP)、左室壓力變化速率（±dp/dtmax）;測定冠脈流量(CF);檢測心肌組織中H2S含量及CSE活性;以Evan’s藍(lán)和TTC雙染法檢測心

9、肌梗死體積。
　　 結(jié)果:
　　 1.與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心功能指標(biāo)LVDP、±dp/dtmax、CF明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，NaHS低、中、高劑量組大鼠心功能指標(biāo)LVDP、±dp/dtmax、CF明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中H2S含量和CSE活性降低(P＜0.01);與模型組比較，NaHS低、中、高劑量組大鼠兩項指標(biāo)均升高(P＜0

10、.05或P＜0.01)。
　　 3.與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死明顯(P＜0.01);與模型組比較，NaHS中、高劑量組大鼠心肌梗死體積明顯減小(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:NaHS可增強急性心肌缺血損傷心肌CSE活性，增加H2S含量，使心肌梗死體積縮小，提示H2S可改善急性心肌缺血損傷。
　　 第三部分:硫化氫對離體急性缺血損傷大鼠心肌組織氧化應(yīng)激的影響
　　 目的:觀察H2S對急性心肌缺血損傷

11、大鼠心肌氧化應(yīng)激的影響，并探討其作用機制。
　　 方法:應(yīng)用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立急性心肌缺血損傷模型。健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(270±20g)，隨機分為假手術(shù)組，模型組，硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組，每組8只。模型組結(jié)扎左冠狀動脈前降支。假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎。硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組分別于心肌急性缺血2h時更換為5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液

12、。分別于缺血后4h取材。分光光度法測定心肌組織中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性;冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)活性;透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.灌流平衡期間各組冠脈流出液中LDH活性無明顯差異。與假手術(shù)組比較，模型組冠脈流出液中LDH活性增高(P＜0.01）;與模型組比較，NaHS低、中、高劑量組冠脈流出液中LDH活性減低（P＜0.0

13、1）。
　　 2.與假手術(shù)組比較，缺血模型組心肌組織MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，NaHS低、中、高劑量組心肌組織MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3.假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊，嵴清晰，無水腫、空泡化;模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，線粒體大量腫脹變形，嵴數(shù)量明顯減少，斷裂、溶解成空泡狀，細(xì)胞核內(nèi)

14、染色體核邊聚;與模型組相比，NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞肌絲、胞核、線粒體等的病變程度較輕。
　　 結(jié)論:NaHS可使急性心肌缺血損傷時心肌細(xì)胞線粒體、胞核、肌絲等的病變程度減輕。冠脈流出液中LDH濃度降低，心肌組織MDA的生成減少，SOD和GSH-Px活性增強，心肌缺血損傷減輕。提示抗氧化應(yīng)激是H2S減輕心肌缺血損傷的重要機制之一。
　　 第四部分:硫化氫對離體急性缺血損傷大鼠心肌組織炎性細(xì)胞因子的影響

15、　　 目的:觀察H2S對急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織核因子-κdB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)等炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，從炎性細(xì)胞因子方面探討H2S對急性心肌缺血損傷的作用及可能的機制。
　　 方法:應(yīng)用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立急性心肌缺血損傷模型。健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)

16、量(270±20g)，隨機分為假手術(shù)組，模型組，硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組，每組8只。模型組結(jié)扎左冠狀動脈前降支。假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎。硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組分別于心肌急性缺血2h時更換為5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液。分別于缺血后4h取材。實時熒光定量PCR(realtimeRT-PCR)測定心肌組織中TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-10、ICAM-1mRNA表達(dá);

17、Westernblot印跡法半定量測定心肌組織中NF-κB的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1mRNA表達(dá)顯著增強，IL-10mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1mRNA表達(dá)明顯降低，NaHS中、高劑量組大鼠心肌組織中IL-10mRNA表達(dá)明顯

18、升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.假手術(shù)組大鼠心肌組織中NF-κdB表達(dá)較低，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠NF-κB表達(dá)顯著增加(P＜0.01）;與模型組比較，NaHS中、高劑量組大鼠NF-κB的表達(dá)明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論:NaHS可抑制急性心肌缺血損傷心肌NF-κdB的活化，下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)，通過抑制炎癥反應(yīng)而減輕心

19、肌缺血損傷。
　　 第五部分:硫化氫對離體急性缺血損傷大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的:觀察H2S對急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響，從細(xì)胞凋亡方面探討H2S對急性心肌缺血損傷的作用及可能的機制。
　　 方法:應(yīng)用Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)建立急性心肌缺血損傷模型。健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(270±20g)，隨機分為假手術(shù)組，模型組，硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組，每組8只

20、。模型組結(jié)扎左冠狀動脈前降支。假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎。硫氫化鈉(NaHS)低、中、高劑量組分別于心肌急性缺血2h時更換為5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的NaHS灌流液。分別于缺血后4h取材。采用HE染色法觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化;末端缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡率;Westernblot印跡法半定量測定心肌組織中Caspase-3和Cyt-c的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.假手術(shù)組大鼠心

21、肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌肌原纖維排列整齊，無變性壞死等改變;模型組大鼠心肌內(nèi)發(fā)生較大范圍局灶性病變，出現(xiàn)明顯變性壞死，心肌纖維呈長波浪形，排列紊亂、斷裂;NaHS低、中、高劑量組心肌病變的程度明顯減輕。
　　 2.假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡水平很低，模型組大鼠凋亡率明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01），NaHS中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.01）。
　　 3.與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織Caspase