硫化氫對(duì)急性病毒性心肌炎心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：病毒性心肌炎(VMC)是因病毒感染和自身免疫反應(yīng)共同引起的心臟局灶性或彌漫性炎癥病變的一種急性或慢性心肌炎性疾病。引起病毒性心肌炎的病毒已知有腸病毒、腺病毒、流感病毒等20多種病毒，腸病毒的柯薩奇病毒3(CoxsackievirusB，CVB)最為常見(jiàn)，約占50％[1]。病程可呈急性或慢性，大多數(shù)可痊愈，約15%的患者由于急性期病情反復(fù)發(fā)展為擴(kuò)張型心肌?。―MC）。臨床上在新生兒、小兒突發(fā)死亡病例中20%因CVB3誘導(dǎo)的VCM所致

2、，死亡率逐年攀升[2]，對(duì)小兒和青少年的健康和生命帶來(lái)極大威脅。CVB3引起的心肌炎癥損傷，進(jìn)而發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病甚至心力衰竭的病理過(guò)程的具體機(jī)制還不十分清楚，但越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是病毒性心肌炎發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[3]，通過(guò)干預(yù)凋亡基因的表達(dá)阻斷心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程以起到保護(hù)心肌的方法備受人們關(guān)注，P53作為一個(gè)高效的凋亡啟動(dòng)因子，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著十分重要的調(diào)控作用，通過(guò)P53泛素化通路對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控，可能是

3、治療VMC的重要靶點(diǎn)。硫化氫(H2S)作為繼一氧化氮和一氧化碳之后第三種氣體信號(hào)分子近年來(lái)備受關(guān)注，國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，在大量心肌疾病動(dòng)物模型研究中被證實(shí)硫化氫能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，發(fā)揮出抗炎癥、抗細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)[4]。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)在CVB3所致對(duì)VMC模型中，外源性硫化氫（NaHS）可通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)影響病毒性心肌炎的發(fā)展，發(fā)揮著減少自由基損害及抑制炎癥反應(yīng)的作用。在大鼠缺血再灌注模型中還起

4、到抑制心肌細(xì)胞凋亡，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用，但對(duì)其抗VMC心肌細(xì)胞凋亡的作用及作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道甚少。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)研究NaHS對(duì)CVB3誘導(dǎo)的急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠心肌的保護(hù)作用，及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P53、BAX／BCL--2表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討NaHS在VMC中調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡及其抗凋亡的作用機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分，將50只4--5周齡近交系純種雄性Balb/C小鼠隨

5、機(jī)分為N組（正常對(duì)照組，n=10）、C組（CVB3病毒對(duì)照組，n=20）、H組（NaHS治療組，n＝20），C、H組小鼠腹腔反復(fù)接種CVB3病毒，H病毒感染同時(shí)分別給予硫化氫，N組每天腹腔注射生理鹽水，每日1次，共7天，建立急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型，觀察并記錄硫化氫對(duì)小鼠一般情況及生存情況，根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)小鼠生存數(shù)，繪制生存曲線進(jìn)行生存分析；死亡小鼠無(wú)菌取出心臟稱(chēng)重，計(jì)算HM/BM，并通過(guò)HE染色觀察各組小鼠心肌病理改變及病理

6、積分，TUNEI法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、Westernblot法檢測(cè)心肌凋亡相關(guān)蛋白P53、BAX／BCL--2的表達(dá)；第二部分實(shí)驗(yàn)將70只Balb/c小鼠隨機(jī)分為4組，N組（正常對(duì)照組， n=10）、C組（CVB3病毒對(duì)照組，n=20）、H組（NaHS治療組，n＝20）、H+P組（Pifithrin--α＋NaHS，n=20），造模同前，H組處理同前，H+P組病毒感染同時(shí)予以P53抑制劑，每日1次，共7天，連續(xù)觀察15天，并各

7、組小鼠在病毒感染后的第3d、7d、10d、14d各組隨機(jī)取3--4只稱(chēng)重處死，無(wú)菌取心臟稱(chēng)重，HE染色光鏡下觀察心肌病理改變，TUNEI法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)，并用Westernblot法檢測(cè)P53泛素化及相關(guān)調(diào)節(jié)因子MDM2/MDMX、COP1以及P53轉(zhuǎn)錄相關(guān)凋亡蛋白BCL--2、BAX、PUMA、Caspase--3蛋白表達(dá)，以進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)研究。
　　結(jié)果：1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，N組小鼠體重增加，未出現(xiàn)死亡，心肌病理改變未見(jiàn)異常，與

8、N組相比較，C組小鼠的體重明顯下降，生存率降低，HM/BM比值增大，心肌病理積分明顯增加，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)上升；H與C組相比較，H組小鼠的一般情況明顯改善，生存率提高，HM/BM比值降低，心肌病理積分明顯減少，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降。與N組比較，C組P53蛋白表達(dá)水平顯著增加（p<0.01）， BCL--2表達(dá)明顯下降，而B(niǎo)AX表達(dá)增強(qiáng)，Caspase--3活性明顯增加；予以NaHS干預(yù)，H組P53蛋白水平表達(dá)較C組明顯降低（p<0.05

9、），BAX蛋白表達(dá)明顯降低， BCL--2蛋白表達(dá)明顯高于C組，Caspase--3活性明顯下降。
　　2）與N組比較，C組心肌組織中P53及P53磷酸化蛋白、MDM2蛋白表達(dá)增加，PUMA、Caspase--3蛋白表達(dá)均明顯增加，MDMX、COP1蛋白表達(dá)明顯減少；給予NaHS干預(yù)治療后,與C組比較，H組P53及P53磷酸化蛋白表達(dá)減少，MDM2蛋白表達(dá)下降，BAX、PUMA蛋白表達(dá)明顯減少，MDMX、COP1、BCL--2蛋白

10、表達(dá)增加（p<0.05）；但NaHS+P53抑制劑干預(yù)后，H+P組小鼠生存率，心肌病理改變、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與C組相比，差異無(wú)顯著性（p>0.05）；但與H組比較，H+P組P53及磷酸化P53、MDM2、BAX、PUMA蛋白表達(dá)升高，MDMX、COP1、BCL--2蛋白表達(dá)繼續(xù)減少，Caspase3活性明顯增加。
　　結(jié)論：NaHS對(duì)CVB3誘導(dǎo)的Balb/c小鼠急性VMC模型心肌細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)控