硫化氫抑制炎癥反應(yīng)和凋亡在心肌缺血損傷中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、隨著溶栓及介入治療技術(shù)的發(fā)展，急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)患者的早期死亡率顯著下降，使得大量存活患者進(jìn)入MI后的恢復(fù)期。心臟在心肌損傷發(fā)生后，為了維持其射血功能，會(huì)進(jìn)行一系列的修復(fù)反應(yīng)，即心室重構(gòu)(cardiac remodeling)，表現(xiàn)為梗死區(qū)急劇擴(kuò)展、變薄，非梗死區(qū)則代償性擴(kuò)張和肥厚。心室重構(gòu)是一個(gè)極其復(fù)雜的病理進(jìn)程，心肌纖維化是其重要環(huán)節(jié)。研究顯示其細(xì)胞/分子機(jī)制主要是肌成纖維細(xì)胞（myof

2、ibroblasts，MyoFBs）在病變部位聚集、增生，大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellullar matrix，ECM):纖維性膠原、纖維連接素、糖蛋白等。研究表明，心肌纖維化中MyoFBs的一個(gè)重要來(lái)源是心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CFs）的激活。
　　炎癥反應(yīng)在心肌損傷后早期病理重構(gòu)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，并與預(yù)后密切相關(guān)。研究表明有一系列炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與心肌損傷的病理生理進(jìn)程，并相互

3、聯(lián)系，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。遺憾的是，目前尚未完全闡明這種炎癥網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制。髓系抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群骨髓來(lái)源的具有CD11b+Gr-1+標(biāo)志（小鼠）的抑制性細(xì)胞，可負(fù)向調(diào)控機(jī)體的免疫功能。MDSCs最初是在腫瘤宿主中被描述，目前已在大量的病理情況下被發(fā)現(xiàn):感染、炎癥、應(yīng)用免疫抑制劑等。小鼠MI早期即可檢測(cè)到大量CD11b+細(xì)胞動(dòng)員和浸潤(rùn)心肌，參與MI急性炎癥反應(yīng)。目

4、前，尚無(wú)關(guān)于CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞在MI后心肌纖維化進(jìn)程中的報(bào)道。
　　硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是一種無(wú)色、水溶性、臭雞蛋氣味的氣體，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為H2S是一種有毒氣體。直到20世紀(jì)90年代，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體存在內(nèi)源性的H2S，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是海馬的功能具有調(diào)節(jié)作用，亦可調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)及血管平滑肌張力等。目前，H2S已成為繼一氧化氮(nitric oxide，NO)及一氧化碳(carbon monox

5、ide，CO)之后的第三個(gè)氣體信號(hào)分子（gasotransmitters），具有舒張血管、心臟保護(hù)、神經(jīng)傳遞，及抗炎作用等。H2S已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的研究，尤其在心血管系統(tǒng)中的應(yīng)用日益增多。Johansen等應(yīng)用Langendorff灌流離體心臟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)模型（結(jié)扎LAD30min，再灌注120m in），結(jié)果顯示，0.1-1μM硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，N

6、aHS)灌流液可減小心肌梗死面積。在體動(dòng)物模型（小鼠、大鼠、豬、犬）研究提示，NaHS(0.1-14μmol/kg)治療可減小心肌梗死面積。更重要的是，通過(guò)減少H2S氣體分子濃度（CSE-/-或使用CSE抑制劑:L-C-Propargylglycine，PAG）則明顯加重心肌損傷。
　　本研究主要探討外源性H2S-硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)對(duì)小鼠心肌缺血損傷后的保護(hù)作用及炎癥反應(yīng)相關(guān)新機(jī)制。對(duì)損傷

7、微環(huán)境內(nèi)心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，開(kāi)展了以下研究:(1)H2S抑制心梗后CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞向心肌組織的浸潤(rùn)和動(dòng)員，減輕心肌損傷;(2)H2S抑制TGF-β1誘導(dǎo)的現(xiàn)在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，減少心梗后心肌纖維化;(3)H2S對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)凋亡信號(hào)通路-Bax/Bcl-2的影響。從一個(gè)嶄新的角度探討H2S對(duì)CD11 b+Gr-1+髓系細(xì)胞在心肌損傷中的調(diào)控作用，以期尋找治療心肌損傷、心肌纖維化的新靶

8、點(diǎn)。
　　本文分為三個(gè)部分。
　　第一部分 硫化氫通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及凋亡保護(hù)急性心肌缺血損傷
　　目的:
　　H2S作為一種內(nèi)源性信號(hào)分子，在心血管系統(tǒng)生理及病理進(jìn)程發(fā)揮著重要作用。髓系抑制性細(xì)胞(MDSCs)是一群骨髓來(lái)源的具有CD11b+Gr-1+標(biāo)志的抑制性細(xì)胞，在各種感染、腫瘤、急慢性炎癥等疾病中大量存在，并負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。本研究主要探討CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞在急性心肌損傷中的作用，觀察N

9、aHS在缺血心肌損傷中的抑制炎癥反應(yīng)及抗心肌細(xì)胞凋亡作用。
　　方法:
　　采用永久結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制備小鼠MI模型。于術(shù)前5 min及術(shù)后60 mim，分別腹腔注射(i.p.) NaHS(1 mg/kg)。觀察術(shù)后24 h動(dòng)物生存率、左心室功能、心肌梗死面積、心肌組織H2S濃度、流水細(xì)胞儀分析CD11b+Gr-1+細(xì)胞水平，及心肌細(xì)胞凋亡等。流式細(xì)胞儀分選脾臟CD11b+Gr-1+細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析。
　　結(jié)果:

10、r>　　NaHS可提高M(jìn)I小鼠的存活率、改善左心室功能、減小心肌梗死面積、提高心肌組織H2S濃度、減少CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞向心肌組織的浸潤(rùn)，并通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡。另外，NaHS減少循環(huán)系統(tǒng)（外周血）的CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞水平，抑制CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞的脾臟動(dòng)員。脾臟組織CD11b+Gr-1+細(xì)胞后進(jìn)行基因芯片結(jié)果提示:H2S可上/下調(diào)一系列與炎癥反應(yīng)、趨化因子及凋亡相關(guān)的

11、基因表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　(1)NaHS對(duì)急性MI所致的心肌損傷具有保護(hù)作用;
　　(2)NaHS抑制CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞向心肌組織浸潤(rùn)和遷移，發(fā)揮抗炎作用;
　　(3)NaHS調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路，減少心肌缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 硫化氫對(duì)小鼠心肌梗死后心肌纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的:
　　急性MI導(dǎo)致心室重構(gòu)，表現(xiàn)為梗死區(qū)急劇擴(kuò)展、變薄，而非

12、梗死區(qū)則擴(kuò)張和肥厚。心室重構(gòu)直接導(dǎo)致心衰發(fā)生，并構(gòu)成影響MI患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前，研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)在心肌損傷后心肌纖維化、心室重構(gòu)病理進(jìn)程具有重要作用。本研究主要觀察CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞在心肌損傷亞急性期(1 wk)及慢性期(4wk)的作用，并探討NaHS在心肌纖維化、心室重構(gòu)進(jìn)程中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　采用永久結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制備小鼠MI模型。于術(shù)前5 min及術(shù)后60 mim，分別腹腔注射(i.p.

13、) NaHS(1 mg/kg)。觀察術(shù)后1 wk和/或4 wk動(dòng)物生存率、左心室功能、存活心肌、心肌纖維化水平、CD11b+Gr-1+細(xì)胞水平、心肌細(xì)胞凋亡，及心臟肥厚和肺水腫等。
　　結(jié)果:
　　NaHS可增加MI后小鼠的存活率、改善心功能及心室結(jié)構(gòu)、增加心肌存活率、抑制CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞向心肌組織的浸潤(rùn)及遷移、減少心肌組織膠原聚集、抑制CFs向MyoFBs的轉(zhuǎn)化、抑制心肌細(xì)胞凋亡，以及減輕MI后心臟肥厚和肺水

14、腫等。
　　結(jié)論:
　　(1)NaHS對(duì)MI后亞急性期(1 wk)及慢性期(4wk)心肌纖維化具有保護(hù)作用;
　　(2)NaHS抑制CD11b+Gr-1+髓系細(xì)胞向心肌組織浸潤(rùn)和遷移，發(fā)揮抗炎作用;
　　(3)NaHS調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路，減少心肌缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;
　　(4)NaHS抑制MI后CFs向MyoFBs的轉(zhuǎn)化，減少膠原纖維的產(chǎn)生，抑制心肌纖維化的進(jìn)程。
　　第三部分 硫

15、化氫抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化
　　目的:
　　心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）在心臟纖維化(myocardial fibrosis，MF)及心室重構(gòu)過(guò)程中具有重要作用。心肌在各種病理因素的刺激下，CFs向MyoFBs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化（特征是大量表達(dá)α-SMA蛋白），并合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth fac

16、tor-β1，TGF-β1）是已明確的重要的刺激因子。本研究主要觀察H2S是否影響TGF-β1誘導(dǎo)的CFs向MyoFBs的表型轉(zhuǎn)化，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　人心臟成纖維細(xì)胞（human cardiac fibroblasts-adult ventricle，HCF-av）在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓16h，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　分為4組:
　　(1)Control;
　　(2)NaHS組:100μMN

17、aHS干預(yù)細(xì)胞;
　　(3)TGF-β1組:10 ng/ml TGF-β1干預(yù)細(xì)胞;
　　(4)NaHS+ TGF-β1組:100μM NaHS干預(yù)細(xì)胞30min，加10 ng/ml TGF-β1。繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及western blot等檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　NaHS可顯著減少細(xì)胞分泌TGF-β1水平，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCF-av細(xì)胞增殖、遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，減少HCF