硫化氫在大鼠腦血管EDHF反應(yīng)中的作用及其抗腦缺血再灌注損傷作用.pdf

1、內(nèi)皮依賴性超極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)是由血管內(nèi)皮產(chǎn)生的一種非一氧化氮、非前列環(huán)素途徑的超極化因子,它通過誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞超極化而誘導(dǎo)血管舒張。EDHF是管徑比較小的阻力血管主要的舒張因子,EDHF及其反應(yīng)在不同種屬、不同血管上也不徑相同,至今腦血管中的EDHF物質(zhì)基礎(chǔ)仍然不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究提示 H2S與大鼠腦血管的EDHF反應(yīng)有關(guān),本課題在此基礎(chǔ)上

2、,采用大鼠在體 CSE基因沉默技術(shù),通過血管舒張實(shí)驗(yàn)及血管平滑肌細(xì)胞超極化實(shí)驗(yàn)來研究確定了大鼠大腦中動脈和基底動脈中 EDHF與 H2S的關(guān)系。
　　腦缺血性損傷在臨床最為常見,但其發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制尚不完全清楚,關(guān)于 H2S在腦缺血損傷中的作用也未有定論。本課題采用 CSE siRNA轉(zhuǎn)染大鼠及CSE基因敲除小鼠腦局灶性腦缺血再灌注模型,研究探討內(nèi)源性 H2S在腦缺血損傷中的作用,并且結(jié)合腦缺血損傷時(shí)腦血管的收縮功能和內(nèi)皮依賴性

3、舒張功能改變來研究H2S抗腦缺血損傷作用的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.研究探討大鼠腦血管中 EDHF反應(yīng)與 H2S的關(guān)系;
　　2.研究確定大鼠腦血管中 EDHF物質(zhì)基礎(chǔ)是否為 H2S;
　　3.確定內(nèi)源性及外源性 H2S在腦缺血再灌注損傷中的作用;
　　4.研究內(nèi)源性 H2S對缺血性腦損傷大鼠大腦中動脈的血管收縮功能和舒張功能的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.采用離體血管舒縮功能測定法以及

4、細(xì)胞內(nèi)電位記錄法,觀察乙酰膽堿對正常大鼠大腦中動脈和基底動脈的舒張和超極化反應(yīng);合用 L-NAME和Indo抑制NO和PGI2的舒張和超極化反應(yīng)后,觀察大鼠大腦中動脈和基底動脈中是否存在 EDHF反應(yīng)。
　　2.采用 CSE siRNA在體轉(zhuǎn)染技術(shù),制備 CSE siRNA轉(zhuǎn)染大鼠模型,用 western blot方法檢測其腦血管中 CSE蛋白的表達(dá),測定各組大鼠血漿 H2S的含量。
　　3.應(yīng)用 CSE siRNA轉(zhuǎn)染大鼠

5、,采用離體血管舒縮功能測定法以及細(xì)胞內(nèi)電位記錄實(shí)驗(yàn)方法,合用 L-NAME和Indo抑制 NO和PGI2的舒血管作用后,觀察大鼠大腦中動脈和基底動脈中EDHF反應(yīng)的改變。
　　4.在 CSE siRNA大鼠中,采用 SKCa和IKCa通道抑制劑 charybdotoxin和apamin合用,觀察 CSE siRNA大鼠大腦中動脈和基底動脈中殘存的超極化和反應(yīng)是否為 EDHF反應(yīng)。
　　5.在 CSE siRNA大鼠中,采用

6、PPG抑制殘存 H2S,觀察腦血管中殘存的EDHF反應(yīng)是否為 H2S介導(dǎo)的。
　　6.采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,研究 NaHS抗腦缺血性損傷作用及其對缺血性損傷大腦中動脈的收舒縮功能和舒張功能的影響。
　　7.制備 CSE siRNA大鼠腦缺血再灌注模型,通過神經(jīng)功能評分、腦水腫、腦梗死體積、腦組織 MDA含量、血清 LDH活力等測定,來觀察內(nèi)源性 H2S在大鼠腦缺血再灌損傷中的作用。
　　8.CSE基因敲除小鼠

7、在制備腦缺血再灌注模型,通過神經(jīng)功能評分、腦水腫、腦梗死體積等測定,觀察內(nèi)源性 H2S在小鼠腦缺血再灌損傷中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、采用離體血管舒縮功能測定法顯示,在1×10-7 mol/L U46619預(yù)收縮大鼠大腦中動脈和基底動脈上,ACh(10-5.5~10-8 mol/L)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生濃度依賴性的血管舒張作用,其最大舒張率在大腦中動脈中可達(dá)73.9±4.2％;基底動脈中為74.6±5.8%。當(dāng)祛除血管內(nèi)皮細(xì)

8、胞后,ACh介導(dǎo)的這種血管舒張反應(yīng)消失。微電極記錄細(xì)胞膜電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 ACh可以引起血管平滑肌細(xì)胞超極化的現(xiàn)象,其最大超極化幅度在大鼠大腦中動脈中可達(dá)-15.2±1.8 mV;基底動脈中為-17.4±2.1 mV。用30μmol/L L-NAME和10μmol/L Indo抑制 NO和PGI2的血管舒張作用后,ACh仍然可以誘導(dǎo)明顯的血管舒張作用,在大鼠大腦中動脈和基底動脈中最大舒張率分別為45.4±3.9%和43.3±4.3%;同

9、時(shí) ACh也可以誘導(dǎo)的血管血管平滑肌超極化,其超極化幅度分別高達(dá)-9.7±2.4 mV和-13.7±1.3 mV。進(jìn)一步應(yīng)用100 nmol/L ChTx和1μmol/L Apa抑制 SKCa和IKCa時(shí),這種非 NO、非 PGI2的血管舒張和超極化作用均消失。
　　2、在 CSE siRNA在體轉(zhuǎn)染大鼠腦血管中,CSE蛋白表達(dá)顯著降低,同時(shí)血漿中H2S含量顯著下降,但單用轉(zhuǎn)染試劑或陰性 siRNA對 CSE表達(dá)及 H2S含量無影

10、響。
　　3、與正常大鼠相比,CSE siRNA轉(zhuǎn)染大鼠大腦中動脈和基底動脈中,ACh介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性的血管舒張作用顯著降低,其最大舒張率分別降低至51.6±6.2%和52.4±4.3%,同時(shí),ACh誘導(dǎo)的超極化幅度分別降至-6.83±0.6 mV和-9.7±1.2mV;當(dāng)抑制了 NO和PGI2時(shí),ACh介導(dǎo)的非 NO、非PGI2的血管舒張最大舒張反應(yīng)分別降至21.3±3.8%(中動脈)、20.2±3.5%(基底動脈);同時(shí)血管平

11、滑肌的超極化幅度分別降至-3.8±1.0 mV(中動脈)、-2.9±0.8 mV(基底動脈)。并且這種超極化和舒張程度的降低與 NO和PGI2的作用無關(guān),而且轉(zhuǎn)染試劑及陰性 siRNA對 ACh誘導(dǎo)的非 NO、非PGI2血管舒張反應(yīng)和超極化均未有顯著影響。
　　4、在 CSE siRNA大鼠大腦中動脈中,抑制 NO和PGI2的舒血管作用的同時(shí)使用 IKCa和SKCa通道阻斷劑,ACh介導(dǎo)殘存的內(nèi)皮依賴性的血管舒張反應(yīng)和超極化反應(yīng)隨

12、之消失。
　　5、在 CSE siRNA大鼠大腦中動脈中,抑制了 NO和PGI2的同時(shí),采用 PPG抑制 CSE后,由 ACh介導(dǎo)的殘存的EDHF反應(yīng)消除。
　　6、在10-5~10-7 mol/kg范圍內(nèi),NaHS對大鼠腦缺血再灌損傷具有保護(hù)作用,并且對腦缺血性損傷大鼠的大腦中動脈的血管收縮功能和內(nèi)皮依賴性舒張功能有保護(hù)作用。
　　7、CSE siRNA大鼠腦缺血再灌注后,神經(jīng)功能評分、腦水腫、腦梗死體積、腦組織 M

13、DA含量及血清 LDH活力均顯著高于未轉(zhuǎn)染大鼠,同時(shí)血管收縮功能和內(nèi)皮依賴性舒張功能均有顯著降低,給予10-6 mol/kg NaHS可逆轉(zhuǎn)這種損傷效應(yīng)。
　　8、CSE基因敲除小鼠腦缺血再灌注后,神經(jīng)功能評分、腦水腫、腦梗死體積均顯著高于同窩野生小鼠模型組,給予10-6 mol/kg NaHS可改善這種損傷作用。
　　結(jié)論:
　　1.大鼠在體轉(zhuǎn)染 CSE siRNA可有效地降低大鼠腦血管內(nèi) CSE的表達(dá)和H2S生成;