NPM和NPM-mA單抗的制備.pdf

1、白血病是造血干細胞克隆性疾病，是一組高度異質(zhì)性的惡性血液病。醫(yī)學(xué)專家建議，針對急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）應(yīng)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。目前世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）采用最新的MIC分型法，根據(jù)細胞形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunology）和細胞遺傳學(xué)（cytogenetic）對AML進行分類，但是仍有約一半的原發(fā)病例因為其核形正常

2、而被歸于分類不明的一類，直接影響此類患者的診斷及預(yù)后，因此，迫切需要尋找更多應(yīng)用于白血病的輔助檢測指標。 核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM）是一種廣泛表達的、主要位于核仁顆粒區(qū)的多功能蛋白，作為組蛋白、p53、ARF（ADP ribosylation factor）、Bax等多種蛋白質(zhì)的分子伴侶，參與調(diào)控細胞的增殖和凋亡。NPM在實體腫瘤中通常表現(xiàn)為高表達，而在血液系統(tǒng)的惡性疾病中，NPM更多的時候是發(fā)生基因突變

3、。NPM突變基因表達的蛋白質(zhì)不僅在細胞中定位發(fā)生改變，由核仁移位至胞漿中，而且其正常生理功能亦受到影響，研究發(fā)現(xiàn)NPM突變與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，白血病中存在多種NPM突變類型，其中NPM A型突變體（Nucleophosmin mutation A，NPM-mA）最常見。因此近年來國外有學(xué)者建議WHO將突變NPM納入白血病分型的輔助檢測指標中。目前突變NPM的檢測方法包括免疫組織化學(xué)染色、分子生物學(xué)方法和變性高效液相分析等。而國內(nèi)

4、臨床常用的免疫組織化學(xué)染色所需的單克隆抗體仍依賴于國外進口，導(dǎo)致該方法的應(yīng)用受限。 1975年Kohler和Milstein發(fā)明的雜交瘤技術(shù)使單克隆抗體的制備成為現(xiàn)實，他們利用小鼠骨髓瘤細胞與綿羊細胞致敏的小鼠脾臟細胞融合，得到的一部分融合細胞既能在體外培養(yǎng)，又能分泌抗羊紅細胞抗體，這種雜交細胞系統(tǒng)被稱為雜交瘤，應(yīng)用這種方法可制備識別單一抗原決定簇的抗體。 本課題主要采用分子克隆技術(shù)和雜交瘤細胞技術(shù)，分別構(gòu)建NPM和NP

5、M-mA與硫氧還蛋白（thioredoxin，TrxA）的融合表達載體，誘導(dǎo)表達及純化兩種融合蛋白質(zhì)，并進一步利用這兩種蛋白免疫小鼠制備相應(yīng)的單克隆抗體。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.利用軟件分析證實NPM與NPM-mA兩種蛋白質(zhì)共同和差異氨基酸序列中均有可能存在抗原表位，利用高保真酶分別擴增兩種蛋白質(zhì)的開放閱讀框序列后成功克隆入原核表達載體pET-32a（+），IPTG誘導(dǎo)含重組載體的兩種表達菌，分泌型表達兩種融合蛋白，