長程施用抗癲癇藥致嬰鼠腦損傷的機理研究.pdf

1、目的：對比性觀察長程施用與臨床治療濃度相匹配的抗癲癇藥PB、CNP、CBZ、VPA和TPM，對健康嬰鼠和成年大鼠腦內(nèi)組織病理學(xué)損傷的不同特征及恢復(fù)的可能性。 方法：健康SD大鼠144只，包括嬰鼠用藥組、長程用藥再停藥4周嬰鼠組和成年鼠用藥組三個觀察組，各組再分為6小組，分別給予PB、CNP、CBZ、VPA、TPM和蒸餾水（對照），每組8只鼠。一日一次灌胃給藥，連續(xù)給藥28天，在各用藥觀察時間點結(jié)束后24小時記錄體重、斷頭處死稱取

2、腦重后，取額葉及海馬行HE和Nssil染色觀察組織學(xué)損傷特征并進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)，用透射電鏡觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：（1）嬰鼠用藥組中僅PB和CNP引起體重和腦重明顯降低，其中腦重降低幅度分別達(dá)對照組的18.3％和19.4％，但停藥4周后其體重和腦重與對照已無明顯差異。（2）HE和Nssil染色光鏡檢查發(fā)現(xiàn)使用PB和CNP后，嬰鼠額葉皮層組織結(jié)構(gòu)模糊，且在皮層及海馬均見細(xì)胞明顯腫脹、胞漿空泡形成，或Nssil小體消失，部分顯示

3、胞核變性等，額葉皮層和海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)均較正常對照組明顯減少。 結(jié)論：（1）長程給予PB和CNP可致嬰鼠腦重明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞變性及數(shù)量明顯減少，電鏡下超微結(jié)構(gòu)顯著異常。提示兩藥對幼鼠認(rèn)知功能的持續(xù)影響是基于它們對未成熟腦的明顯組織學(xué)損傷。（2）嬰鼠長程給予PB和CNP并長時間停藥后，大鼠的腦重、神經(jīng)細(xì)胞損傷及其數(shù)量雖都有不同程度的恢復(fù)，但額葉皮層和海馬各區(qū)神經(jīng)元計數(shù)依然遠(yuǎn)低于同齡對照組。 目的：對比性觀察長程施用與

4、臨床治療濃度相匹配的抗癲癇藥PB、CNP、CBZ、VPA和TPM，對健康嬰鼠和成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的不同影響。 方法：健康SD大鼠288只，包括嬰鼠用藥組、長程用藥再停藥4周嬰鼠組，及成年鼠用藥組三個觀察組，各組再分為6小組，分別給予PB、CNP、CBZ、VPA、TPM和蒸餾水（對照），每組16只鼠。一日一次灌胃給藥，連續(xù)給藥28天。取與第一部分中HE染色緊鄰腦片用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測腦內(nèi)凋亡細(xì)胞，免疫組化法檢測

5、腦內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。 結(jié)果：（1）嬰鼠用藥組中僅PB和CNP引起大鼠額葉和海馬TUNEL陽性細(xì)胞明顯增高，與同齡對照比較，PB致額葉和海馬神經(jīng)TUNEL陽性細(xì)胞的增加達(dá)1.80倍和2.45倍（P<0.0001）。（2）嬰鼠用藥組中僅PB和CNP引起大鼠額葉和海馬Bax蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.0001），而Bcl-2蛋白與對照無明顯差異，進(jìn)而導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值均較對照顯著性增高達(dá)1.57～2.26

6、倍和1.74～2.29倍。 結(jié)論：（1）長程給予治療劑量PB和CNP存在致未成熟腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞廣泛過度凋亡可能性，停藥后此種異常凋亡將會逐漸消失。（2）PB和CNP導(dǎo)致的未成熟腦損傷主要通過上調(diào)Bax蛋白，導(dǎo)致胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值和線粒體膜電位增高，進(jìn)而激活Caspase酶系這一內(nèi)源性凋亡途徑，導(dǎo)致不可逆性過度凋亡發(fā)生。 目的：對比性觀察長程施用與臨床治療濃度相匹配的抗癲癇藥PB、CNP、CBZ、VPA和TPM，對健

7、康嬰鼠和成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞線粒體內(nèi)氧化-抗氧化體系、呼吸鏈酶活性和ATP酶活性的不同影響，探索線粒體功能受損在AEDs導(dǎo)致的過度凋亡啟動中關(guān)鍵性作用。 方法：健康SD大鼠144只，包括嬰鼠用藥組、長程用藥后再停藥4周嬰鼠組和成年鼠用藥組三個觀察組，各組再分為6小組，分別給予PB、CNP、CBZ、VPA、TPM和蒸餾水（對照），每組8只鼠。一日一次灌胃給藥，連續(xù)給藥28天。在各用藥觀察時間點結(jié)束后24小時處死，分離額葉皮層和海馬

8、并提取各自的線粒體，分光光度計測定線粒體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，以及線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ與Na+K+-ATP酶活性。 結(jié)果：（1）除了TPM外，其余4種藥均導(dǎo)致包括嬰鼠和成年鼠額葉皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體抗氧化指標(biāo)SOD活性和GSH含量不同程度的降低，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA不同程度的升高。（2）長程施用PB和CNP導(dǎo)致嬰鼠額葉皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性顯著降

9、低（P<0.0001）。與對照相比，PB對額葉皮層和海馬復(fù)合物I的降低分別為28％和37％，CNP為33％和35％；而PB對額葉皮層和海馬復(fù)合物Ⅳ的降低分別為34％和33％，CNP為35％和32％。停藥4周后，降低的復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性均有所恢復(fù)，與對照組無顯著差異。而嬰鼠用藥組中的CBZ、VPA和TPM組及所有的成年用藥組兩酶活性與對照組相比無明顯差異。 結(jié)論：（1）與CBZ、VPA和TPM不同，長程給予PB和CNP可致嬰鼠腦細(xì)胞

10、線粒體氧化-抗氧化持續(xù)且更為嚴(yán)重的失衡狀態(tài)，主要表現(xiàn)為GSH和SOD等主要抗氧化物質(zhì)活性明顯降低。（2）線粒體遭受的氧化應(yīng)激性損傷和能量代謝損傷是PB和CNP誘發(fā)未成熟腦細(xì)胞過度凋亡的關(guān)鍵性啟動環(huán)節(jié)。（3）長程給予PB和CNP導(dǎo)致的嬰鼠腦內(nèi)線粒體損傷在停藥后可逐漸恢復(fù)正常，未顯示持久不可逆性線粒體功能異常。（4）在成年鼠中長程給予PB和CNP，以及嬰鼠和成年鼠中長程給予CBZ和VPA后也均發(fā)生程度較輕的線粒體抗氧化物質(zhì)活性降低，和脂質(zhì)過

11、氧化增高，但呼吸酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ的活性，以及Na+K+-ATP酶活性均未發(fā)生改變，也未造成明顯細(xì)胞凋亡和腦組織學(xué)損害，提示實驗動物體內(nèi)相關(guān)的代償機制阻止了線粒體功能實質(zhì)性破壞和過度凋亡發(fā)生。 目的：對比性觀察長程施用與臨床治療濃度相匹配的抗癲癇藥PB、CNP、CBZ、VPA和TPM，對健康嬰鼠和成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)Ca2+超載的危險性與發(fā)生機理，及腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的不同影響。 方法：健康SD大鼠288只，包括嬰

12、鼠用藥組、長程用藥再停藥4周嬰鼠組和成年鼠用藥組三個觀察組，各組再分為6小組，分別給予PB、CNP、CBZ、VPA、TPM和蒸餾水（對照），每組16只鼠。一日一次灌胃給藥，連續(xù)給藥28天。取與第一部分中HE染色緊鄰腦片用免疫組化法檢測腦內(nèi)NMDA-R1、BDNF和NT-3的表達(dá)。 結(jié)果：（1）嬰鼠用藥組中僅PB和CNP引起皮層和海馬細(xì)胞的胞內(nèi)和線粒體內(nèi)Ca2+濃度顯著增高，其中胞內(nèi)Ca2+濃度增幅為對照的48％～57％（P<0.

13、0001），而線粒體Ca2+濃度的增加更是高達(dá)85％～97％（P<0.0001）。停藥4周后，PB和CNP所致嬰鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)和線粒體增高的Ca2+明顯回落，較對照組已無顯著性差異。而成年鼠長程施用這5種AEDs均未導(dǎo)致胞內(nèi)或線粒體內(nèi)Ca2+濃度的明顯變化。（2）無論從蛋白水平還是基因水平均未發(fā)現(xiàn)PB和CNP導(dǎo)致NMDA-R1改變。（3）使用這5種AEDs后，無論嬰鼠還是成年鼠，腦內(nèi)BDNF和NT-3蛋白與基因水平表達(dá)呈一致下調(diào)，但嬰鼠組

14、較成年鼠組下降明顯，而嬰鼠組中又以PB和CNP下降更突出。 結(jié)論：（1）長程給予PB和CNP可致嬰鼠腦內(nèi)與過度凋亡相一致的胞內(nèi)和線粒體內(nèi)鈣超載。（2）PB和CNP導(dǎo)致的未成熟腦內(nèi)Ca2+超載并沒有通過增加NMDA-R1密度來加強NMDAR介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流，但與線粒體內(nèi)ROS異常增多及促凋亡Bax蛋白增高有更大關(guān)系。（3）蛋白和基因水平的檢測均一致發(fā)現(xiàn)，長程給予PB、CNP、CBZ、VPA和TPM后導(dǎo)致的嬰鼠和成年鼠腦內(nèi)BD

15、NF和NT-3不同程度的下降。 目的：初步探索生后早期長程施用臨床治療血藥濃度的PB、CNP、CBZ、VPA和TPM，對大鼠未成熟腦內(nèi)海馬新生細(xì)胞增殖、存活及神經(jīng)發(fā)生的影響。 方法：健康生后7日齡SD大鼠192只，分為6小組，分別給予PB、CNP、CBZ、VPA、TPM和蒸餾水（對照），每組32只鼠。一日一次灌胃給藥，連續(xù)給藥28天后，腹腔注射BrdU（150mg/kg×3）。其中一半大鼠于注射BrdU后24h處死進(jìn)行B

16、rdU、DCX、BrdU/DCX雙標(biāo)免疫組化檢測及DCX免疫印跡檢測，以反應(yīng)用藥后海馬新生細(xì)胞增殖及新生神經(jīng)元發(fā)生情況；另一半于注射BrdU后28天處死進(jìn)行BrdU、NeuN和BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo)免疫組化檢測，及NeuN免疫印跡檢測，以觀察海馬新生細(xì)胞存活及分化狀態(tài)。 結(jié)果：（1）BrdU給藥后24小時，PB和CNP組的BrdU+細(xì)胞較對照下降了63％和59％（P<0.01），同時反映神經(jīng)發(fā)生的DCX水平也

17、較對照明顯降低，但BrdU+/DCX+細(xì)胞比率卻較對照組為高。未發(fā)現(xiàn)CBZ，VPA和TPM組對新生細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生有明顯改變。（2）28天后，BrdU+細(xì)胞較先前BrdU給藥后24小時水平更明顯降低，對照組有58％的新生細(xì)胞存活，而PB和CNP組的新生細(xì)胞存活率僅為45％和51％（P<0.01）。BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+細(xì)胞占總BrdU+細(xì)胞的水平卻與對照無明顯差異，海馬齒狀回NeuN+細(xì)胞和海馬總體NeuN蛋白