促?；鞍?受體C5L2在脂肪細(xì)胞分化和胰島素抵抗中的作用研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：
　　 闡明促?；鞍资荏w在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)的時序性規(guī)律。
　　 方法
　　 1.采用激素“雞尾酒”誘導(dǎo)方法，誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，即細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，油紅O 染色觀察胞漿中脂滴的聚集。
　　 2.熒光顯微鏡觀察ASP 受體C5L2在細(xì)胞膜定位、分布規(guī)律。
　　 3.采用RT-P

2、CR 方法，檢測C5L2在前脂肪細(xì)胞分化不同階段mRNA 表達(dá)。
　　 4.采用流式細(xì)胞儀檢測C5L2在前脂肪細(xì)胞分化不同階段蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣長梭形，胞漿中無脂滴；分化成熟后，細(xì)胞變大、變圓，胞漿可見明顯的脂滴，呈“戒環(huán)”狀。
　　 2.C5L2 主要表達(dá)于細(xì)胞膜，前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞有中度表達(dá)，分化早期表達(dá)較強。
　　 3.在誘導(dǎo)分

3、化0d，C5L2 mRNA 有低水平的表達(dá)，誘導(dǎo)分化1d C5L2 mRNA 表達(dá)明顯增加，誘導(dǎo)分化3d，6d和9d C5L2 mRNA 水平分別是0d的2.08倍、2.44倍和3.56倍。
　　 4.在誘導(dǎo)分化0d，C5L2蛋白陽性表達(dá)率為(50.71±14.58)[％]，誘導(dǎo)分化6h C5L2蛋白表達(dá)增加了21[％] ；分化12h達(dá)高峰，增加了38[％]；分化1d 增加了11[％]，并逐漸減少；分化3d基本恢復(fù)至0d水平，分

4、化6d和9d C5L2表達(dá)與0d無顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 ASP 受體在前脂肪細(xì)胞分化過程中的發(fā)生、發(fā)育、定位具有時序性和空間分布規(guī)律。
　　 第二部分
　　 目的：
　　 1.觀察不同濃度單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸對3T3-L1(前脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響，探討高游離脂肪酸負(fù)荷在胰島素抵抗和ASP抵抗形成中的意義，以期闡明高FFA負(fù)荷誘導(dǎo)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下同時存在ASP抵抗。
　

5、　 2.探討FFA 誘導(dǎo)的3T3-L1(前)脂肪細(xì)胞ASP 抵抗的機制。
　　 方法：
　　 1.采用2-脫氧-[3H]-D-葡萄糖摻入法，觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞最大葡萄糖攝取率時最佳胰島素作用濃度和時間；在此基礎(chǔ)上檢測不同濃度油酸、棕櫚酸孵育過夜后3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)、胰島素刺激狀態(tài)和ASP 刺激狀態(tài)的葡萄糖攝取率。
　　 2.分別采用RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測FFA 孵育過夜

6、3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞C5L2 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 3.3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞分別給予0 μmol/L和5.0 μmol/L ASP 刺激4h后，采用Western Blot 法檢測Gβ，Gαq/11，p-PKCα和p-PKC ζ蛋白表達(dá)。
　　 4.3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞給予FFA 孵育過夜后，采用Western Blot 法檢測基礎(chǔ)狀態(tài)和ASP 刺激的Gβ，Gαq/

7、11，p-PKCα和p-PKC ζ蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.100 nmol/L 胰島素作用1h 細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運率最強，根據(jù)此研究結(jié)果，選擇100 nmol/L 胰島素作用1h 以判斷FFA 對胰島素激發(fā)的葡萄糖轉(zhuǎn)運率的影響。
　　 2.0.125 mmol/L～1.0 mmol/L 油酸和棕櫚酸不影響3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)的葡萄糖轉(zhuǎn)運，但呈濃度依賴性抑制細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運。

8、　　 3.ASP刺激后，3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率明顯增加，分別是基礎(chǔ)狀態(tài)的1.98倍，表明ASP 具有促進脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的能力。低濃度FFA不影響ASP刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運；隨著FFA濃度增加，ASP刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運明顯下調(diào)。
　　 4.高濃度FFA 能顯著性抑制3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞C5L2-mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 5.ASP 顯著增強特異性Gβ，Gαq/11，p-PKCα和p-PK

9、C ζ蛋白表達(dá)。
　　 6.在前脂肪細(xì)胞，油酸分別抑制ASP 刺激的23[％]Gβ，4[％]Gαq/11，39[％]p-PKCα和19[％]p-PKC ζ蛋白表達(dá)；棕櫚酸組ASP 刺激的蛋白表達(dá)分別減少了45[％]Gβ，50[％]Gαq/11，52[％]p-PKCα和21[％]p-PKC ζ。
　　 結(jié)論：
　　 1.油酸或棕櫚酸抑制3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞胰島素刺激和ASP 刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，首次

10、證明FFA 誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下同時存在ASP 抵抗。
　　 2.ASP-C5L2 通過激活Gβ，Gαq/11，PKCα和PKC ζ信號分子發(fā)揮調(diào)控脂肪細(xì)胞分化及葡萄糖轉(zhuǎn)運等生物學(xué)作用。
　　 3.FFA 誘導(dǎo)的ASP 抵抗的發(fā)生機制與下調(diào)脂肪細(xì)胞表面ASP 受體功能有關(guān)，與干擾ASP-C5L2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。ASP 抵抗參與了“脂毒性”-胰島素抵抗/肥胖癥的病理生理過程。
　　 第三部分

11、　　 目的：
　　 1.觀察不同濃度17β-雌二醇、睪酮和孕酮對3T3-L1(前)脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響，探討高性激素負(fù)荷在胰島素抵抗和ASP 抵抗形成中的意義，以期闡明高性激素負(fù)荷誘導(dǎo)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下同時存在ASP 抵抗。
　　 2.探討性激素誘導(dǎo)的3T3-L1(前)脂肪細(xì)胞ASP 抵抗的機制。觀察性激素對3T3-L1(前)脂肪細(xì)胞ASP 受體C5L2-mRNA和細(xì)胞表面C5L2蛋白表達(dá)的影響，以期從受體水平探討

12、ASP 抵抗的機制；觀察性激素對3T3-L1(前)脂肪細(xì)胞Gβ，Gαq/11，p-PKCα
　　 和p-PKC ζ蛋白以及ASP 刺激的Gβ，Gαq/11，p-PKCα和p-PKC ζ蛋白表達(dá)的影響，以期從受體后信號分子水平探討ASP 抵抗的機制。
　　 方法：
　　 1.采用2-脫氧-[3H]-D-葡萄糖摻入法，檢測不同濃度17β-雌二醇、睪酮和孕酮孵育過夜后3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)、胰島

13、素刺激狀態(tài)和ASP 刺激狀態(tài)的葡萄糖攝取率。
　　 2.分別采用RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測性激素孵育過夜3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞C5L2 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 3.3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞給予性激素孵育過夜后，采用Western Blot 法檢測基礎(chǔ)狀態(tài)和ASP 刺激的Gβ，Gαq/11，p-PKCα和p-PKC ζ蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.10-8 mol/L

14、～10-6 mol/L 17β-雌二醇、睪酮和孕酮不影響3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)的葡萄糖轉(zhuǎn)運。胰島素刺激后，10-6 mol/L 17β-雌二醇和睪酮分別顯著性抑制39[％]和42[％]成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運，而孕酮對成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運無明顯抑制作用；在前脂肪細(xì)胞，10-8 mol/L和/或10-7 mol/L 17β-雌二醇和睪酮能輕度增加胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，高濃度時分別抑制32[％]和40[％]前脂肪細(xì)

15、胞葡萄糖轉(zhuǎn)運；孕酮呈濃度依賴性抑制前脂肪細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，最大抑制率為38[％].
　　 2.ASP 刺激狀態(tài)，10-8 mol/L～10-7 mol/L 17β-雌二醇和睪酮對3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運無顯著性差異，10-6 mol/L 時分別抑制46[％]和46[％]成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率，10-7 mol/L和10-6 mol/L 孕酮分別抑制55[％]和52[％]成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率。在前脂肪細(xì)

16、胞，高濃度性激素均顯著抑制ASP 刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運。
　　 3.10-8 mol/L 17β-雌二醇輕度增加3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞C5L2-mRNA和蛋白的表達(dá),但前脂肪細(xì)胞C5L2-mRNA和蛋白表達(dá)水平均無顯著性差異。
　　 4.高濃度性激素在一定程度上抑制ASP 刺激的成熟脂肪細(xì)胞Gβ，Gαq/11，p-PKCα和p-PKC ζ的表達(dá)，17β-雌二醇組ASP 刺激的蛋白表達(dá)分別減少了23[％]，17

17、[％]，15[％]和15[％]；睪酮組分別減少了27[％]，52[％]，50[％]和57[％]；孕酮組分別減少了63[％]，41[％]，49[％]和32[％]。在前脂肪細(xì)胞，10-6 mol/L 17β-雌二醇顯著性抑制24[％]ASP刺激的Gαq/11蛋白表達(dá)，睪酮對前脂肪細(xì)胞ASP-C5L2 下游信號分子Gβ，Gαq/11，p-PKCα和p-PKC ζ表達(dá)無明顯抑制作用；高濃度孕酮顯著性抑制ASP 刺激的43[％]Gβ，59[％]G

18、αq/11，51[％]p-PKCα和30[％]p-PKC ζ的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.性激素抑制3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞胰島素刺激和ASP 刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，提示在性激素誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下同時存在ASP 抵抗。
　　 2.性激素誘導(dǎo)的ASP 抵抗的發(fā)生機制與下調(diào)脂肪細(xì)胞表面ASP 受體功能有關(guān)，與干擾ASP-C5L2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。ASP 抵抗參與了高雌二醇、睪酮和孕酮引起