脂肪細(xì)胞膜相關(guān)蛋白在妊娠期糖尿病胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：評估妊娠期糖尿病(GDM)患者孕期及產(chǎn)后6-8周胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，探索GDM患者產(chǎn)后胰島素抵抗的影響因素。同時(shí)應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較妊娠期糖尿病患者和糖代謝正常孕婦網(wǎng)膜脂肪組織蛋白的表達(dá)差異，找尋妊娠期糖尿病胰島素抵抗的干預(yù)靶點(diǎn)。最后，利用3 T3-L1脂肪細(xì)胞模型在體外模擬 GDM孕婦脂肪組織，探索蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到的差異蛋白脂肪細(xì)胞膜相關(guān)蛋白(APMAP)在胰島素抵抗中的作用。
　　方法：納入來我

2、院產(chǎn)檢的孕周匹配的GDM孕婦和糖耐量正常(NGT)的孕婦各60例。比較兩組一般資料、胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)；同時(shí)納入產(chǎn)后6-8周來我院隨訪的有GDM病史的患者223例，行75g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。觀察GDM患者產(chǎn)后6-8周的臨床轉(zhuǎn)歸；比較GDM產(chǎn)后糖代謝正常和糖代謝異常患者、產(chǎn)后糖尿病和糖尿病前期患者的一般資料、胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。最后利用多重線性回歸分析找尋GDM產(chǎn)后胰島素抵抗的獨(dú)立影響因素；蛋白質(zhì)組學(xué)檢測樣品來源

3、于我院接受剖宮產(chǎn)手術(shù)的GDM和NGT孕婦各6例，術(shù)中留取腹部網(wǎng)膜脂肪組織。脂肪組織經(jīng)過裂解、蛋白定量后，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析獲取肽段質(zhì)譜圖。運(yùn)用Maxquant分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，獲取蛋白質(zhì)信息并進(jìn)行基因注釋和功能分類，同時(shí)計(jì)算表達(dá)差異的蛋白。最后挑選表達(dá)差異較大的蛋白APMAP利用Western blot和免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證；體外試驗(yàn)，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，分化過程第2、4、6、8天檢測APMAP的表達(dá)

4、量。在APMAP表達(dá)穩(wěn)定后利用siRNA干擾的方法特異性抑制脂肪細(xì)胞APMAP的表達(dá)并進(jìn)行驗(yàn)證。利用Western blot的方法檢測抑制 APMAP表達(dá)后對脂肪細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及 NFκB炎癥通路的影響。
　　結(jié)果：孕24-28周時(shí)，GDM孕婦與NGT孕婦胰島素分泌指數(shù)(HOMA-β)無明顯差異，GDM孕婦胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)明顯高于NGT孕婦；48.4%的GDM患者在產(chǎn)后6-8周仍存在不同程度的糖代謝異常；G

5、DM患者產(chǎn)后6-8周糖代謝異常的患者HOMA-β無明顯變化，但 HOMA-IR較高(P＜0.01)；多元逐步回歸分析結(jié)果顯示低齡生育，產(chǎn)后高BMI，低密度脂蛋白(LDL-C)、2小時(shí)血糖和1小時(shí)胰島素水平升高以及有糖尿病家族史是GDM產(chǎn)后胰島素抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果共鑒定蛋白3528個(gè)，差異表達(dá)蛋白66個(gè)。其中47個(gè)在GDM患者網(wǎng)膜脂肪組織中表達(dá)下調(diào)，19個(gè)表達(dá)上調(diào)，APMAP是其中下調(diào)較明顯的蛋白之一；細(xì)胞定位結(jié)果顯示鑒定

6、到的蛋白中68.2%為細(xì)胞質(zhì)蛋白，15%為膜蛋白；免疫組化結(jié)果證實(shí)APMAP屬于膜蛋白，Western blot結(jié)果也顯示APMAP在GDM孕婦脂肪組織中表達(dá)明顯下調(diào)；體外試驗(yàn)中，APMAP的表達(dá)量從脂肪細(xì)胞分化的第2天到第6天逐漸增加，至第6-8天趨于穩(wěn)定；在成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中抑制 APMAP的表達(dá)，IRS-1和 Akt表達(dá)無明顯變化，但胰島素刺激后p-IRS-1和p-Akt表達(dá)較正常對照組明顯減少。同時(shí)，抑制APMAP表達(dá)

7、后，脂肪細(xì)胞p65表達(dá)無明顯變化，p-p65較對照組明顯增多。
　　結(jié)論：胰島素抵抗是GDM孕期及產(chǎn)后糖代謝異常主要病理生理基礎(chǔ)。48.4%的GDM患者產(chǎn)后6-8周存在糖代謝異常，加強(qiáng)產(chǎn)后糖篩查有助于2型糖尿病的早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)。通過生活方式的干預(yù)適當(dāng)降低產(chǎn)后體重、血脂和血糖水平有助于緩解胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)適用于妊娠期糖尿病患者網(wǎng)膜脂肪組織的分析，蛋白檢出較多，膜蛋白覆蓋率較高，膜蛋白APMAP在GDM患者網(wǎng)膜脂肪