促甲狀腺激素與脂肪細胞胰島素抵抗的相關性研究.pdf

1、論文一TSH與大鼠胰島素抵抗及脂肪組織GLUT4達關系的動物實驗研究
　　近年來，關于促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)與肥胖、代謝綜合征的相關研究成為國內(nèi)外學者關注的熱點。國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)，即使甲狀腺功能在正常范圍內(nèi)，血清TSH水平與體重指數(shù)(body mass index，BMI)、胰島素抵抗程度均呈顯著正相關，與胰島素敏感性指數(shù)呈顯著負相關。然而，TSH引起胰島素抵抗的具體機制尚

2、未明確，需要進一步研究。
　　脂肪組織是胰島素的主要外周靶組織。胰島素靶細胞的糖攝取主要是依靠葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter4，GLUT4）實現(xiàn)的，GLUT4特異性表達于胰島素敏感的脂肪細胞及骨骼肌中，基礎狀態(tài)下大部分儲存于胞內(nèi)囊泡中，胰島素刺激后可使其轉(zhuǎn)位至細胞膜，同時糖轉(zhuǎn)運活性增強，攝取血液中的葡萄糖以維持血糖的穩(wěn)定。胰島素抵抗與GLUT4的表達量及胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)運量減少有關，甲減或亞臨床甲減人群的胰

3、島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulinresistance index，HOMA-IR)升高，但是尚無TSH升高與GLUT4表達關系的研究報道。
　　本研究擬建立亞臨床甲減、臨床甲減、高脂飲食肥胖大鼠模型，應用高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術及HOMA-IR指數(shù)評價大鼠胰島素抵抗程度，并檢測內(nèi)臟及皮下脂肪組織GLUT4mRNA與蛋白的表達水平。探討TSH水平升高對胰島素抵抗和GLUT4表達

4、的影響。
　　方法:
　　將48只雄性Wistar大鼠隨機分成4組(n=12):完全甲減組(clinicalhypothyroidism，CH):手術完全切除甲狀腺，術后一個月開始于頸背部皮下注射等體積0.9％的氯化鈉溶液。亞臨床甲減組(subclinical hypothyroidism，SCH):手術切除甲狀腺，術后一個月開始于頸背部皮下注射L-T4溶液0.95μg/(100g·d)建立亞臨床甲減模型。高脂肥胖組(HF)

5、:給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方20％豬油、5％蔗糖、5％蛋黃粉、2％膽固醇、0.5％膽酸鈉、67.5％普通飼料。正常對照組(NC):行甲狀腺切除假手術，術后一個月開始于皮下注射等體積0.9％的氯化鈉溶液，作為陰性對照。術后自注射藥物8周后，眶后靜脈采血測定甲功、血脂、空腹血胰島素，行麻醉狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗;留取附睪周圍內(nèi)臟脂肪組織和腹股溝皮下脂肪組織，應用Real-time PCR技術檢測內(nèi)臟和皮下脂肪GLUT4、腫瘤壞

6、死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)、胰島素受體底物-1(insulin receptorsubstrate-1，IRS-1)mRNA的表達水平，應用Western blotting技術檢測上述指標蛋白水平的表達。采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行處理。
　　結果:
　　1.術后4周CH組

7、與SCH組大鼠的體重均明顯低于NC組與HF組(P＜0.05)。實驗終點時HF組大鼠體重最重（657.2±29.7g），CH組體重最低(331.3±57.0g)，SCH組大鼠體重(445.1±42.7g)雖較CH組大鼠有明顯的增加(P＜0.05)，但仍較NC組（546.7±64.2g）及HF組的體重明顯降低(P＜0.05)。實驗終點時眶后靜脈采血測定TSH及TT4，顯示TSH值CH組（17.89±5.3mIU/L）和SCH組（3.57±0

8、.38mIU/L）較NC組（0.47±0.08 mIU/L）、HF組（0.33±0.05 mIU/L）均明顯升高(P＜0.05);而CH組TT4（1.41±0.42μg/dl）較其他三組均明顯降低(P＜0.05)，SCH組TT4（5.63±0.56μg/dl）與NC組（5.49±0.72μg/dl）、HF組（6.18±0.88μg/dl）無明顯差異，模型制備成功。
　　2.CH組、SCH組和HF組大鼠的鉗夾實驗60～120min的

9、平均葡萄糖輸注率（glucose infusion rate，GIR60-120）較NC組明顯下降(P＜0.05)，CH組GIR60-120明顯低于SCH組(P＜0.05);而此三組的HOMA-IR也比NC組的明顯升高(P＜0.05)，均以HF組最明顯，CH組與SCH組無明顯差異。表明甲減和亞臨床甲減大鼠均存在一定程度的胰島素抵抗。
　　3.GLUT4和其他相關因子在大鼠附睪周圍內(nèi)臟脂肪和腹股溝皮下脂肪的表達水平和變化趨勢基本一致

10、。結果顯示，CH組、SCH組和HF組大鼠脂肪組織GLUT4和IRS-1 mRNA的表達均較NC組的表達明顯下調(diào)(P＜0.05)，TNF-αmRNA的表達均較NC組明顯上調(diào)（P＜0.05），且以HF組的下調(diào)或上調(diào)更為顯著。四組之間TSHR mRNA的表達無明顯差異。Western blotting檢測脂肪組織蛋白表達，結果顯示，CH組和SCH組大鼠脂肪組織GLUT4蛋白表達均較NC組表達下降(P＜0.05);HF組、CH組和SCH組TNF

11、-α蛋白表達均較NC組表達升高(P＜0.05); HF組、CH組和SCH組大鼠附睪周圍內(nèi)臟脂肪p-IRS-1(ser307)蛋白表達較NC組明顯升高(P＜0.05)，且以CH組升高最為明顯;CH組大鼠皮下脂肪組織p-IRS-1(ser307)蛋白表達較NC組明顯升高(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.TSH水平升高并未改變大鼠脂肪組織的TSHR表達。
　　2.TSH水平升高會加重大鼠胰島素抵抗，可能部分是通過上調(diào)脂

12、肪組織TNF-α表達、下調(diào)GLUT4表達來實現(xiàn)的。
　　論文二TSH對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取及TNF-α達影響的實驗研究
　　在流行病學研究中發(fā)現(xiàn)，血清促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)水平升高與胰島素抵抗顯著正相關。本課題動物實驗發(fā)現(xiàn)，甲減與亞臨床甲減大鼠的胰島素抵抗明顯加重，而且胰島素抵抗的主要外周靶組織脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter

13、4，GLUT4)表達下調(diào)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)表達上調(diào)，這些變化是否與體內(nèi)升高的TSH水平有關系需要進一步驗證。
　　本研究擬培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞并進行誘導分化，應用TSH刺激分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，觀察TSH對其葡萄糖攝取和GLUT4表達的影響;同時研究TSH對細胞分泌TNF-α的影響及促進其分泌的可能信號通路。
　　方法:
　　誘導分化3T3-L1脂

14、肪細胞8～10天，應用油紅O染色鑒定分化程度。對分化成熟的脂肪細胞應用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基過夜，給予不同濃度(0、0.1mIU/ml、1 mIU/ml、10mIU/ml)的TSH刺激48h，分別采用2-脫氧-3H-D-葡萄糖攝入法檢測葡萄糖攝取量和氧化酶法葡萄糖測定試劑盒測定培養(yǎng)基葡萄糖消耗量;給予濃度0.1 mIU/ml TSH孵育0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，或者給予不同濃度的TSH（0，0.01 mIU/ml，

15、0.1 mIU/ml，1mIU/ml，10 mIU/ml）孵育細胞4h，收集細胞上清和沉淀，ELISA方法檢測上清中TNF-α的濃度，Real-time PCR方法檢測細胞TNF-α mRNA的表達。給予不同濃度(0、0.1 mIU/ml、1 mIU/ml、10 mIU/ml)的TSH刺激48h，檢測細胞GLUT4 mRNA及蛋白水平的表達;另設一組細胞應用TNF-α拮抗劑Rapamycin(20nmol/L)預處理1h后予TSH(1

16、mIU/ml)刺激48h，收集細胞測定GLUT4 mRNA及蛋白水平。分組加藥刺激，分別予磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3-K)抑制劑Wortmannin(10-6mol/L)干預30分鐘、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，P38MAPK)抑制劑SB203580（10-5mol/L）干預30分鐘、蛋白激酶A抑制劑H89(0.01mmo

17、l/L)干預15分鐘，其后三組細胞予TSH(1mIU/ml)刺激48h，同時設立空白對照組和單純TSH(1mIU/ml)干預組，Western blotting技術測定細胞TNF-α蛋白水平的表達。細胞爬片鋪板，誘導分化成熟后，H89（0.01mmol/L）干預15分鐘，其后予或不予TSH(1mIU/ml)刺激48h，同時設立空白對照組和單純TSH(1mIU/ml)干預組，進行GLUT4免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡拍照比較GLUT4表

18、達強弱。
　　結果:
　　3T3-L1脂肪細胞經(jīng)誘導分化10天，油紅O染色細胞胞漿內(nèi)可見較多亮紅色顆粒，證實誘導分化成功。胰島素刺激的細胞葡萄糖攝取被認為是測定胰島素敏感性的金標準，每分鐘的衰變數(shù)(decay per minute，DPM)越高提示脂肪細胞的葡萄糖攝取量越多，有胰島素刺激時，DPM值明顯升高。隨著TSH刺激濃度的增加，顯示3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取量逐漸下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 vs基線）。

19、而且，TSH會降低3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖消耗量(P＜0.05 vs基線)，抑制效應與TSH濃度呈正相關。
　　3T3-L1成熟脂肪細胞在0.1 mIU/ml TSH刺激后，細胞TNF-α mRNA的表達及培養(yǎng)基中TNF-α濃度明顯上調(diào)，與基線水平相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.001)，并于刺激4h達峰值。與空白對照組相比，隨著TSH濃度的增加，TNF-α mRNA的表達和培養(yǎng)基中TNF-α的濃度呈上升趨勢，差異

20、均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.001)。
　　不同濃度TSH（0、0.1 mIU/ml、1 mIU/ml、10 mIU/ml）刺激3T3-L1成熟脂肪細胞48h。與空白對照組相比，隨著TSH濃度的增加GLUT4 mRNA和總蛋白的表達水平明顯下降(P＜0.001 vs基線);予TNF-α的拮抗劑Rapamycin預處理1h，再予TSH1 mIU/ml刺激48h后，Rapamycin可以逆轉(zhuǎn)這一效應，且與空白對照組相比差異無

21、統(tǒng)計學意義。
　　應用三種信號通路抑制劑作用3T3-L1成熟脂肪細胞后，再予TSH刺激細胞48h，結果顯示H89明顯地抑制TNF-α蛋白的表達(P＜0.001)，而Wortmannin和SB203580未能夠抑制3T3-L1脂肪細胞TNF-α的表達。免疫熒光結果顯示，單純應用TSH刺激后，GLUT4的熒光強度較空白對照組明顯減弱;而給予H89刺激后，應用或不應用TSH刺激48h，GLUT4的熒光強度均較單純應用TSH刺激48h的有

22、所增強。
　　結論:
　　1.TSH能降低3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的攝取量及培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗量，增加脂肪細胞的胰島素抵抗程度。
　　2.TSH可以通過增加TNF-α的表達來下調(diào)GLUT4的表達，且TSH可以部分通過蛋白激酶A途徑促進TNF-α的表達。
　　論文三不同腰圍切點值對評估中國成人代謝綜合征患病率和危險因素的影響
　　隨著中國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，中國人的生活方式有了很大改變，導致超重與肥胖患病

23、率的快速升高。截止到2008年底，全世界超重及肥胖癥患者已達15億，其中20％是中國人。超重和肥胖是代謝綜合征(metabolic syndrome，MetS)的核心組份，而MetS是心血管疾病(cardivascular disease，CVD)和糖尿病的主要危險因素。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)提出的MetS診斷標準強調(diào)了中心性肥胖是診斷MetS的先決條件而且可將腰圍測定作為一個簡單的篩查工具，同時也強調(diào)了腰圍的種族差異。對亞裔成年人，

24、除日本以外，IDF將中心性肥胖腰圍切點定義為男性≥90cm，女性≥80cm。
　　然而上述腰圍切點并不太適用于中國成年女性，多項研究成果建議將中國成人腹型肥胖的最佳腰圍切點分別設為男性≥90cm，女性≥85cm。本研究小組應用此腰圍切點及中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會(JCDCG)提出的MetS標準來進行橫斷面流行病學調(diào)查。研究人群來自2007～2008年中華醫(yī)學會糖尿病分會組織的中國糖尿病和代謝性疾病研究。
　　方

25、法:
　　由中國糖尿病和代謝性疾病研究小組應用多級分層、整群抽樣方法在全國14個省、市及自治區(qū)進行了此項橫斷面調(diào)查研究。共有45157名20～74歲的中國居民參與調(diào)查，參與調(diào)查者需完成一份調(diào)查問卷，收集臨床資料包括人口學基本特征、個人史、家族史、生活方式危險因素如吸煙和飲酒等。調(diào)查內(nèi)容也包括既往高血壓病、糖尿病、脂代謝紊亂和其他慢性疾病的診斷與治療情況。按照統(tǒng)一標準進行體格檢查，采集被調(diào)查者的身高、體重、腰圍和血壓;并抽取靜脈血檢

26、測空腹血糖、血脂及759糖負荷后30min、120min的靜脈血糖。分別應用國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的標準和修訂版IDF標準定義MetS，分析比較兩種標準下不同腰圍切點對MetS患病率和相關危險因素的影響。
　　結果:
　　經(jīng)年齡標化的MetS患病率分別為24.2％(IDF)和19.5％（修訂版IDF），而代謝綜合征前期的患病率為8.1％。按照這兩個診斷標準，代謝綜合征的患病率隨著年齡增加有明顯的升高，且女性較男性的升高趨勢

27、更明顯。
　　三個不同經(jīng)濟水平地區(qū)的農(nóng)村居民MetS患病率明顯低于城鎮(zhèn)居民(IDF標準，22.1％ vs.26.5％，P＜0.001;修訂版IDF標準，17.7％ vs.21.3％，P＜0.001)。以秦嶺-淮河一線為界劃分中國南北地域，北方MetS患病率較南方明顯升高(IDF標準，28.0％ vs.19.7％，P＜0.001;修訂版IDF標準，23.1％ vs.14.7％，P＜0.001)。按性別分層，不論農(nóng)村還是城鎮(zhèn)地區(qū)，不論

28、南方還是北方地區(qū)，女性MetS的患病率修訂版IDF標準明顯低于IDF標準(P＜0.001)。
　　20～74歲男性中心性肥胖的患病率達到35.1％，女性中心性肥胖的患病率分別是47.5％(IDF標準)和29.7％（修訂版IDF標準）;就代謝綜合征單一組份而言，血壓升高或者高血壓的患病率是最高的，男性高達65.4％，女性達到53.0％(IDF)和58.9％（修訂版IDF標準）;除女性低水平的HDL-C這一組份之外，另三項組份患病率在

29、中心性肥胖者中IDF標準低于修訂版IDF標準（P均＜0.001）。超過40％的肥胖男性和超過30％的肥胖女性有兩項代謝綜合征異常組份。對兩種標準定義的女性中心性肥胖者中擁有兩項及兩項以上代謝綜合征異常組份的患病率，修訂版IDF標準定義的明顯偏高(P＜0.05)。
　　多元回歸分析證實，許多危險因素包括年齡、城鎮(zhèn)居住、較高的經(jīng)濟發(fā)展水平、當前吸煙、酒精攝入、糖尿病家族史、高血壓家族史和肥胖家族史均與代謝綜合征有明顯相關性，文化水平則