STARS在棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗中的作用.pdf

1、隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的提高，我國(guó)2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高，而2型糖尿病合并的心腦眼腎等器官的慢性并發(fā)癥，往往導(dǎo)致其高死亡率和高致殘率，嚴(yán)重威脅人類健康。胰島素抵抗是2型糖尿病的重要的發(fā)病機(jī)制，但其具體機(jī)制尚不清楚，而高脂是誘發(fā)胰島素抵抗的重要危險(xiǎn)因素。
　　Rho信號(hào)橫紋肌激活劑（thestriatedmuscleactivatorofRhosignalling，STARS）,它是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在心肌，骨骼肌

2、和平滑肌特異性表達(dá)，主要與肌節(jié)的I蛋白和肌絲結(jié)合。近年來有研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者以及糖耐量正常但有胰島素抵抗的一級(jí)親屬其骨骼肌中STARS表達(dá)增加并與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)，而且高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠骨骼肌STARS表達(dá)也增加，并且能用胰島素增敏劑羅格列酮糾正。下調(diào)STARS表達(dá)后骨骼肌葡萄糖的攝入增加。這些都表明STARS可能與胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)。
　　血漿反應(yīng)因子（Serumresponsefactor，SRF）是一個(gè)重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)

3、錄調(diào)控因子，主要存在于3種組織-心肌、骨骼肌和平滑肌。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者以及糖耐量正常但有胰島素抵抗的一級(jí)親屬其骨骼肌SRF調(diào)節(jié)的基因表達(dá)增加，而且SRF抑制劑CCG-1423能夠改善高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的糖耐量。巨核細(xì)胞白血病因子1（megakaryoblasticleukemia1，MKL1）是一種單項(xiàng)調(diào)節(jié)的輔因子，也是STARS激活SRF的一個(gè)重要的輔助因子。SRF、MKL1是STARS的下游因子，在STARS的許多生物學(xué)作用中發(fā)

4、揮著重要作用。STARS是否通過MKL1或SRF進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗尚不清楚。
　　本課題采用棕櫚酸孵育L6成肌細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗模型，并通過質(zhì)粒上調(diào)和siRNA下調(diào)肌細(xì)胞中STARS的表達(dá)，研究STARS在骨骼肌胰島素抵抗中的作用以及其下游信號(hào)通路。
　　目的：研究STARS在棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化大鼠L6成肌細(xì)胞，將成肌細(xì)胞分化成骨骼肌細(xì)胞，并用棕櫚酸

5、（PA）孵育，建立胰島素抵抗模型。實(shí)驗(yàn)分組如下，上調(diào)STARS表達(dá)的實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（control），空質(zhì)粒組（pcDNA），STARS過表達(dá)組（pcDNA/STARS），棕櫚酸組（PA），棕櫚酸空質(zhì)粒組（PA+pcDNA），棕櫚酸STARS過表達(dá)組（PA+pcDNA/STARS）；下調(diào)STARS表達(dá)的實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（control），siRNA陰性對(duì)照組（NC-siRNA），STARS敲低組（si-STARS），棕櫚酸組（PA），

6、棕櫚酸siRNA陰性對(duì)照組（PA+NC-siRNA），棕櫚酸STARS敲低組（PA+si-STARS）。通過RT-PCR及Western方法檢測(cè)STARSmRNA及蛋白表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染成功后，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定各組細(xì)胞的葡萄糖攝取率評(píng)價(jià)胰島素的敏感性。采用RT-PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)SRF、MKL1，以及胰島素信號(hào)通路中AKT、IRS-1、及GLUT4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣

7、本間比較采用t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1、L6成肌細(xì)胞成功分化
　　與未分化的L6成肌細(xì)胞相比，成功分化組標(biāo)志性基因Desmin和MyogeninmRNA的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　2、棕櫚酸干預(yù)后各指標(biāo)變化：PA組培養(yǎng)基中葡萄糖含量較control組明顯升高（18.01±1.03mmol/Lvs.13.13±0.70mmol/L），表明胰島素敏感性下降（P＜0.05）。與contr

8、ol組相比，PA組STARS基因表達(dá)明顯增加（P＜0.05），IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)均明顯下降（均P＜0.05），STARS、p-IRS-1（ser307）蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05），p-AKT、GLUT4蛋白表達(dá)均明顯下降（均P＜0.05）；
　　3、STARS上調(diào)后各指標(biāo)變化：與control相比，pcDNA/STARS組肌細(xì)胞STARS基因和蛋白表達(dá)均顯著增加；與PA組相比，PA+pcDNA/STAR

9、S組肌細(xì)胞STARS基因和蛋白表達(dá)均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明STARS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。與control相比，pcDNA/STARS組肌細(xì)胞IRS-1、GLUT4和AKT基因表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MKL1、SRF基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05），AKT、IRS-1總蛋白水平無明顯變化（P＞0.05），p-IRS-1蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），p-AKT和GLUT

10、4蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）。與PA組相比，PA+pcDNA/STARS組肌細(xì)胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平顯著增加和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達(dá)均顯著降低（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　4、STARS下調(diào)后各指標(biāo)的變

11、化：與control相比，si-STARS組肌細(xì)胞STARS基因和蛋白表達(dá)均顯著降低；與PA組相比，PA+si-STARS組肌細(xì)胞STARS基因和蛋白表達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明STARSsiRNA轉(zhuǎn)染成功。與control相比，si-STARS組肌細(xì)胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化（均P>0.05），但是p-IRS-1（

12、ser307）表達(dá)明顯降低和p-AKT、GLUT4蛋白表達(dá)明顯升高（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。與PA組相比，PA+si-STARS組肌細(xì)胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平表達(dá)顯著降低和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05

13、），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高脂孵育可以導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗以及STARS表達(dá)增肌，同時(shí)伴有胰島素信號(hào)通路的變化。
　　2、通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA調(diào)節(jié)STARS的表達(dá)，胰島素信號(hào)通路中AKT、IRS-1和GLUT4的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)變化。說明STARS與胰島素抵抗密切相關(guān)，為STARS作為一個(gè)新的胰島素抵抗或2型糖尿病的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

14、　　3、調(diào)節(jié)STARS的表達(dá)雖然并不能引起其下游靶點(diǎn)MKL1和SRF表達(dá)的變化，但是STARS可能通過影響其修飾后翻譯，也可能通過其他信號(hào)通路在胰島素抵抗中發(fā)揮作用，其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。（均P＞0.05），p-IRS-1蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），p-AKT和GLUT4蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）。與PA組相比，PA+pcDNA/STARS組肌細(xì)胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平顯著增加和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達(dá)均顯著降低（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　4、STARS下調(diào)后各指標(biāo)的變化：與control相比，si-STARS組肌細(xì)胞STARS基因和蛋白表達(dá)均顯著降低；與PA組相比，PA+si-STARS組肌細(xì)胞STARS基因和蛋白表

16、達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明STARSsiRNA轉(zhuǎn)染成功。與control相比，si-STARS組肌細(xì)胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化（均P>0.05），但是p-IRS-1（ser307）表達(dá)明顯降低和p-AKT、GLUT4蛋白表達(dá)明顯升高（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。與

17、PA組相比，PA+si-STARS組肌細(xì)胞IRS-1、AKT、GLUT4基因表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IRS-1和AKT總蛋白沒有明顯變化，但是IRS-1絲氨酸磷酸化（ser307）水平表達(dá)顯著降低和AKT磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05），SRF和MKL1基因和蛋白水平均沒有明顯變化（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高脂孵育可以導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗以及STARS

18、表達(dá)增肌，同時(shí)伴有胰島素信號(hào)通路的變化。
　　2、通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA調(diào)節(jié)STARS的表達(dá)，胰島素信號(hào)通路中AKT、IRS-1和GLUT4的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)變化。說明STARS與胰島素抵抗密切相關(guān)，為STARS作為一個(gè)新的胰島素抵抗或2型糖尿病的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。
　　3、調(diào)節(jié)STARS的表達(dá)雖然并不能引起其下游靶點(diǎn)MKL1和SRF表達(dá)的變化，但是STARS可能通過影響其修飾后翻譯，也可能通過其他信號(hào)通路在胰島素抵