28816.水飛薊賓干預(yù)棕櫚酸誘導(dǎo)骨骼肌細胞胰島素抵抗作用的研究

1、DissertationSubmittedtoZhejiangUniversityofTechnology⑧fortheDegreeofMaster一‘1‘p一’‘‘●一‘‘InterventionOtSilibinininInsulinResistanceinSkeletalMuscleCellsInducedbyPalmitateCandidate：YingDingAdvisor：HanbingLiCollegeofPharmace

2、uticalScience，ZhejiangUniversityofTechnologyMay，2014浙江工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文水飛薊賓干預(yù)棕櫚酸誘導(dǎo)骨骼肌細胞胰島素抵抗作用的研究摘要目的：探究體外培養(yǎng)C2C12骨骼肌成肌細胞的增殖分化過程及特征，優(yōu)化培養(yǎng)分化條件，建立基于熒光標記的葡萄糖轉(zhuǎn)運模型，利用棕櫚酸孵育誘導(dǎo)骨骼肌細胞胰島素抵抗，探討水飛薊賓對胰島素抵抗的干預(yù)作用及相關(guān)機制。方法：(1)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)C2

3、C12細胞，通過形態(tài)學(xué)考察來檢測其增殖狀況；待細胞成長到匯合至80～90％，用含1％胎牛血清(v／v)和含2％馬血清(v／v)的培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)細胞分化，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。Hoechst染色，熒光顯微鏡觀察：(2)利用熒光探針2NBDG表征骨骼肌細胞攝取葡萄糖，應(yīng)用酶標儀和熒光顯微鏡考察細胞對2NBDG的轉(zhuǎn)運，評估其作為光學(xué)探針檢測骨骼肌細胞攝取葡萄糖的能力確定其最佳作用濃度和最佳作用時間；(3)棕櫚酸孵育骨骼肌細胞16h，

4、通過考察骨骼肌細胞在胰島素刺激下對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，評價飽和脂肪酸棕櫚酸對骨骼肌細胞胰島素敏感性的影響，建立胰島素抵抗模型：(4)考察骨骼肌細胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)的表達和轉(zhuǎn)位的變化：利用Westernblot檢測胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵環(huán)節(jié)AKT、pAKT(Ser473)、pIRS—l(Ser307)和相關(guān)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶pJNK、pigaq3、pPKC一0的表達，同時分析細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)和活性氧(RO

5、S)的變化，探討水飛薊賓改善飽和脂肪酸誘導(dǎo)的骨骼肌細胞胰島素抵抗的作用機制。結(jié)果：(1)正常C2C12細胞呈梭形，誘導(dǎo)分化過程中多個細胞發(fā)生融合成一個細胞，并且細胞呈現(xiàn)極性，規(guī)律性的沿一個方向逐漸平行排列，形成肌管，Hoechst染色可見多個細胞核。2％的馬血清誘導(dǎo)細胞分化形成的肌管較為粗壯，數(shù)量較少，l％的胎牛血清誘導(dǎo)細胞分化形成的肌管較為細長，但數(shù)量較多。(2)肌管攝取2NBDG最佳濃度為100“molL～，最佳時間為30min。(