胰島素誘導(dǎo)基因（Insig2）在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化與脂肪合成中作用的研究.pdf

1、第一部分葡萄糖濃度對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化及insig-1和-2 mRNA表達(dá)的影響。 目的:胰島素誘導(dǎo)基因(insig)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新基因，在脂質(zhì)合成與脂肪細(xì)胞的分化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。觀(guān)察不同葡萄糖濃度對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化及insig-1，-2 mRNA表達(dá)的影響，探討insig在脂肪細(xì)胞分化與脂肪代謝中的作用。 方法:將3T3-L1 細(xì)胞分別在不同葡萄糖濃度(5.5mol/L和25mol/L)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化

2、，用紅“O”染色、RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞的分化、insig-1，-2 mRNA 及脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(AP<,2>)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：隨著 3T3-L1 細(xì)胞的分化，insig-1，-2 mRNA、AP<,2> mRNA 表達(dá)逐漸上調(diào)；但低糖誘導(dǎo)組的細(xì)胞分化程度顯著低于高糖誘導(dǎo)組；低糖誘導(dǎo)組的insig-1，-2 mRNA 表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組明顯增高(P<0.05)，而AP<,2>mRNA表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組

3、明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論:在3T3-L1 細(xì)胞分化過(guò)程心中，insig基因表達(dá)逐漸上調(diào)，低糖時(shí)insig的表達(dá)上調(diào)更明顯，此可能與低糖時(shí)脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)沉積相對(duì)受抑制有關(guān)。 第二部分insig-2過(guò)表達(dá)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化與相關(guān)基因的影響。 第一章 EGFP-C<,3>-insig-2和pcDNA3.1(+)-insig-2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及insig-2的亞細(xì)胞定位。 目的:構(gòu)建 E

4、GFP-C3-insig-2 和 pcDNA3.1(+)-insig-2融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒，探討insig-2基因的亞細(xì)胞定位與表達(dá)，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 3T3-L1 細(xì)胞insig-2過(guò)表達(dá)對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響。 方法:采用RT-PCR法從3T3-L1細(xì)胞獲取小鼠的全長(zhǎng)insig-2基因，經(jīng)T載體克隆、鑒定后，分別克隆入真核表達(dá)載體 pEGFP-C<,3>及pcDNA3.1(+)中。酶切、測(cè)序?qū)Σ迦肫芜M(jìn)行分析和鑒定后，用脂質(zhì)

5、體轉(zhuǎn)染法將帶綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-C<,3>瞬時(shí)轉(zhuǎn)入3T3-L1細(xì)胞，-通過(guò)熒光顯微鏡、RT-PCR檢測(cè)其在3T3-L1細(xì)胞中的表達(dá)、定位及下游基因AP<2> mRNA的變化。 結(jié)果：酶切、測(cè)序鑒定所插入片段的大小和基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-C<,3>-insig-2 和 pCDNA3.1(+)-insig-2 融合基因真核表達(dá)載體。pEGFP-C<,3>-insig-2真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

6、3T3-L1細(xì)胞后，該融合蛋白在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞漿中表達(dá)；insig-2基因的轉(zhuǎn)錄明顯增強(qiáng)，而其下游基因AP2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論：insig-2 蛋白在3T3-L1 細(xì)胞中定位于胞漿，過(guò)表達(dá)時(shí)影響其脂肪代謝。 第二章 insig-2 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化和脂質(zhì)合成的影響。 目的：研究pCDNA3.1(+)-insig-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞后insig-2基因過(guò)表達(dá)在3T3-L1脂肪細(xì)胞

7、分化和脂肪形成中的作用。 方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒 pCDNA3.1(+)-insig-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染組、pCDNA3.1(+)空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染的3T3-L1細(xì)胞(空白對(duì)照組)的細(xì)胞周期與凋亡率；用油紅“O”染色鑒定分析細(xì)胞的誘導(dǎo)分化；用半定量RT-PCR測(cè)定各組3T3-L1前脂肪細(xì)胞及分化過(guò)程中insig-2、insig-1、固醇調(diào)節(jié)元件

8、結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins SREBPs)、SREBP 裂解活性蛋白(cleavage-activating protein SCAP)、脂肪酸合成酶(FAS)、AP2基因的mRNA表達(dá)；用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的insig-2蛋白表達(dá)。 結(jié)果：半定量RT-PCR檢測(cè)和免疫組化分析結(jié)果顯示，insig-2 mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照

9、組均顯著增加，提示pCDNA3.1(+)-insig-2成功轉(zhuǎn)染的3T3-L1細(xì)胞呈高效表達(dá)，但對(duì)其前體細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率無(wú)明顯影響；誘導(dǎo)分化后的第6和12天，pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染組的成熟脂肪細(xì)胞明顯少于兩個(gè)對(duì)照組，且分化過(guò)程中三組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)染后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞insig-2相關(guān)基因insig-1、FAS、AP2、SREBP1c mRNA均表達(dá)下調(diào)；隨著細(xì)胞的分化，上述基因mRNA表達(dá)均

10、上調(diào)，但pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染組的insig-2較其他兩個(gè)對(duì)照組顯著上調(diào)，而FAS和AP2 mRNA明顯下調(diào)。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染后insig-2高表達(dá)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化及脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)。 第三章 insig-2基因過(guò)表達(dá)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響。 目的：脂聯(lián)素對(duì)糖代謝、脂代謝和能量平衡的調(diào)控有重要作用。觀(guān)察pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染后3T3-L1前脂

11、肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及其分化過(guò)程中的脂聯(lián)素分泌，探討insig基因過(guò)表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌的影響。 方法：以轉(zhuǎn)染 pCDNA3.1(+)及未轉(zhuǎn)染的3T3-L1細(xì)胞為對(duì)照組，半定量RT-PCR檢測(cè)pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染后24 h和72h 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素mRNA表達(dá)。用ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)染后3T3-L1前脂肪細(xì)胞及其在誘導(dǎo)分化過(guò)程中的脂聯(lián)素動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果：3T3-L1前脂肪細(xì)胞pC