核轉(zhuǎn)錄因子Nrf-1在脂肪細(xì)胞侵華及砷致胰島素抵抗中的作用.pdf

1、目的：脂肪細(xì)胞在能量儲存和代謝中發(fā)揮著重要的作用，由其所分泌的不同因子具有影響食欲、胰島素敏感性、炎癥反應(yīng)以及其他生物學(xué)通路的作用，具有重要臨床意義。肥胖，是慢性代謝綜合癥的主要病因之一，機(jī)體通常處于慢性氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。然而，活性氧在肥胖的發(fā)生發(fā)展中的作用卻一直不清。核轉(zhuǎn)錄因子NE-E2相關(guān)因子(Nrfs)是啟動抗氧化反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC家族的堿性亮氨酸拉鏈蛋白。在本研究組最新的研究中已證實，Nrf2可以通過調(diào)控PPARγ

2、的表達(dá)而影響脂肪細(xì)胞的形成過程，鑒于Nrf1在結(jié)構(gòu)以及在調(diào)控抗氧化酶基因等功能上與Nrf2的相似，以及在不同器官中的獨特作用，我們認(rèn)為其在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程中極可能存在與Nrf2相似的功能。因此，我們用含有針對小鼠Nrf1基因的sh-RNA慢病毒，感染小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系，建立小鼠Nrf1基因沉默的前脂肪細(xì)胞系，并進(jìn)一步研究該基因在脂肪細(xì)胞分化和脂肪代謝過程中的作用。
　　 砷及其化合物是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確

3、認(rèn)的人類致癌物。長期飲用高砷水除可導(dǎo)致砷性皮膚損傷及皮膚癌、內(nèi)臟腫瘤、心血管疾病外，近年來的流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，砷中毒還可以導(dǎo)致糖尿病的高發(fā)。那么，低濃度砷長期暴露是否可以導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞胰島素敏感性下降，即胰島素抵抗，目前，還沒有相關(guān)機(jī)制研究。因此，在本研究中，我們試圖探討低濃度的砷是否可以通過對Nrf1或Nrf2的調(diào)控而激活抗氧化酶，進(jìn)而抑制胰島素刺激脂肪細(xì)胞糖攝取所依賴的ROS信號傳導(dǎo)通路，而導(dǎo)致胰島素抵抗。
　　 方法：

4、>　　 1、研究對象
　　 1)細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞系購至ATCC。培養(yǎng)時應(yīng)用含有10％小牛血清(CS)、50 units/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2，95％大氣條件下培養(yǎng)。
　　 2)細(xì)胞分化
　　 分化誘導(dǎo)劑為：地塞米松(Dexamethasone，簡寫為Dex)、異丁基甲基黃嘌呤(Isobutylmethylxanthine，簡寫

5、為IBMX)和胰島素(Insulin)，上述三者組合而成的誘導(dǎo)劑簡稱為“DMI”。此外，為加快細(xì)胞的分化速度，還可以向DMI中補(bǔ)充添加羅格列酮(Rosiglitazone，簡寫為Rosi)和吲哚美辛(Indomethacin，簡寫為Indo)。上述五種誘導(dǎo)劑的組合可簡稱為“DMIRI”或“All”。含有分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基稱為“分化培養(yǎng)基”。
　　 2、建立Nrf1沉默的3T3L1細(xì)胞系MISSION短發(fā)卡RNA(shRNA)慢病

6、毒顆粒購于Sigma。按產(chǎn)品手冊將針對基因Nrf1(SHVRS-NM-008686)或非針對性的Scramble陰性對照(Scr，SHC002V)的顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞系。轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時，細(xì)胞以40-50％的融合率被接種于6孔板。次日，以每孔8μg/ml和2×105TU(Transducing Units，傳導(dǎo)單位)的濃度向細(xì)胞中分別添加海美溴銨(Hexadimethrine bromide)和病毒顆粒。隔夜孵育后，將含有

7、病毒顆粒的培養(yǎng)基換為含有2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)的新鮮培養(yǎng)基，對細(xì)胞進(jìn)行篩選，建立Nrf1基因沉默和Scr穩(wěn)定傳染的細(xì)胞模型。待細(xì)胞達(dá)到90％融合后，用含有puromycin的培養(yǎng)基將其傳代。其中，在進(jìn)行傳導(dǎo)實驗之前，先確定于3-5天內(nèi)可將全部細(xì)胞殺死的puromycin的濃度。
　　 3、油紅染色(Oil-red Stainning)油紅染色步驟如下：將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，冷PBS沖洗細(xì)胞3次，于10％中性緩沖福

8、爾馬林(10％neutral-buffered formalin)中固定5分鐘，冷PBS再次沖洗細(xì)胞3次，并于搖床上連續(xù)沖洗5分鐘，其間換液2次。棄去PBS后于油紅染料中染色30分鐘，而后用PBS再次沖洗細(xì)胞，上掃描儀掃描。
　　 4、蛋白提取、定量與Western Blot免疫印跡法(Western blot)檢測上述基因的蛋白表達(dá)情況：收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞后，提取總蛋白。核蛋白提取按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取后置于-80℃保存。

9、調(diào)整總蛋白或核蛋白濃度一致，進(jìn)行蛋白電泳。蛋白電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉后分別加入適當(dāng)比例稀釋的一抗雜交，然后加入各自相應(yīng)的二抗再次雜交。
　　 5、mRNA提取與定量Real-time PCR分析應(yīng)用TRIzol(invitrogen)法進(jìn)行細(xì)胞總mRNA提取。定量Real time PCR操作方法主要步驟如下，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總RNA經(jīng)MuLV反轉(zhuǎn)錄酶和OligodT，dNTP轉(zhuǎn)錄為cDNA。充分混合后，首先經(jīng)25℃

10、，10 min；48℃，60 min合成cDNA，然后于95℃加熱5min，終止反應(yīng)，4℃?zhèn)溆谩Ｊ褂肧YBR Green試劑盒(Applied Biosystem)進(jìn)行Real-time PCR分析。
　　 6、急性細(xì)胞毒性檢測(MTT)細(xì)胞按每孔5×104濃度接種于96孔板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁24小時，之后倒掉培養(yǎng)液，用含有不同濃度亞砷酸鈉(5-50μM)的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24或48小時，之后用非放射活性細(xì)胞增值試劑盒(

11、G5430，美國Promega公司)檢測細(xì)胞活力，結(jié)果用砷暴露組與對照組(不含砷的培養(yǎng)液)的百分比表示，同時制作細(xì)胞活性線性圖形，并記錄LC50(細(xì)胞的半數(shù)致死劑量)。比較3T3L1細(xì)胞Nrf1基因沉默對砷誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的反應(yīng)。
　　 7、胰島素敏感性實驗AKT磷酸化實驗(pAKT-Ser407)與[3H]-2-脫氧葡萄糖攝取([3H]-2-deoxy-D-glucose uptake)實驗被用于亞砷酸鈉處理的成熟脂肪細(xì)胞的胰島素

12、敏感性實驗。
　　 8、細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)水平的測定應(yīng)用BIOXYTECH GSH/GSSG-412試劑盒(Oxis Research)進(jìn)行總GSH(Glutathione)與GSSG(Glutathion disulfide)分析。
　　 9、統(tǒng)計與分析應(yīng)用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析與制圖。用單因素方差分析(ANOVA)比較各組之間的統(tǒng)計學(xué)差異，所有實驗結(jié)果均來自3個以上平行樣品或3次以上重復(fù)

13、實驗，以P<0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立Nrf1基因沉默小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞系Real time-PCR結(jié)果顯示成功建立了Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A細(xì)胞系與sh-Nrf1-L細(xì)胞系。
　　 2、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)分析對sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)進(jìn)行分析，Nrf1全型基因沉默可以顯著降低細(xì)胞

14、中Gclc、Gclm、Nqo1的基因的表達(dá)，而不改變HO1的表達(dá)：Nrf1長型基因沉默可以降低Gclc、Nqo1的基因的表達(dá)，而不改變Gclm、HO1的表達(dá)。
　　 3、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞急性細(xì)胞毒性實驗經(jīng)5-50μM和5-35μM亞砷酸鈉染毒24、48小時后，3種細(xì)胞活力均隨著亞砷酸鈉濃度的增高而逐漸變低，其中Nrf1基因沉默細(xì)胞(sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞)對砷暴露表現(xiàn)出敏感性。

15、>　　 4、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞Nrf1蛋白表達(dá)Western結(jié)果顯示Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞系相應(yīng)的被沉默的Nrf1蛋白，表達(dá)均顯著降低。
　　 5、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)分析sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞的Cebpα、δ、Pparγ、Pparγ1和Pparγ2的基因表達(dá)均高于對照Scramble細(xì)胞

16、、sh-Nrf1-A細(xì)胞的Cebpβ的基因表達(dá)高于對照Scramble細(xì)胞。
　　 6、Nrf1基因沉默3T3L1細(xì)胞的分化能力油紅染色顯示，Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A細(xì)胞系與sh-Nrf1-L細(xì)胞系分化能力增強(qiáng)。
　　 7、sh-Nrf1-L細(xì)胞分化7天、24小時和8小時過程中脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因與蛋白的變化Real time-PCR與Western結(jié)果顯示sh-Nrf1-L細(xì)胞分化7天、24小時和

17、8小時過程中，其Pparγ的表達(dá)均高于Scramble對照細(xì)胞。
　　 8、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可降低成熟脂肪細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，并呈現(xiàn)時間、劑量-效應(yīng)。
　　 9、砷致脂肪細(xì)胞ROS的產(chǎn)生長期低劑量亞砷酸鈉暴露可增加成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)。
　　 10、砷致脂肪細(xì)胞抗氧化基因與蛋白的表達(dá)長期低劑量亞砷酸鈉暴露可增加成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化酶的基

18、因和蛋白水平的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 11、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞GSH含量的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露不改變成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)GSH的含量。
　　 12、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞Nrf1與Nrf2基因與蛋白表達(dá)的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可以增加Nrf2基因與蛋白的表達(dá)，而不改變Nrf1基因的表達(dá)，并降低Nrf1蛋白的表達(dá)。
　　 13、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞分化與炎性介質(zhì)基因表達(dá)的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可

19、以降低Cebpα、Pparγ1和Pparγ2的基因表達(dá)，并增高炎性介質(zhì)Tnf-α、IL-6、IL-1β、iNos和Cox-2的基因表達(dá)。
　　 14、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞IRS-1-p-AKT通路的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可以增強(qiáng)基礎(chǔ)水平的p-IRS1-Ser307和p-AKT-Ser473蛋白的表達(dá)，降低基礎(chǔ)水平的p-PI3K的蛋白表達(dá)，使成熟脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性下降。
　　 15、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞Glut1與

20、Glut4 mRNA表達(dá)的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露不改變基礎(chǔ)水平的Glut1基因表達(dá)，而降低Glut4表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功獲得Nrf1全型和長型基因沉默的小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞模型，且核轉(zhuǎn)錄因子Nrf1參與調(diào)控抗氧化酶和分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 2、Nrf1基因沉默可通過提高前脂肪細(xì)胞中Pparγ的表達(dá)而增強(qiáng)分化。
　　 3、長期低劑量亞砷酸鈉暴露通過提高抗氧化酶的表達(dá)而抑制胰島素刺