N-硬脂酰酪氨酸介導(dǎo)內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)的神經(jīng)保護作用及其機制研究.pdf

1、自上個世紀90年代初期發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)以來，目前被證實的內(nèi)源性大麻素有N-花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酰甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)，它們通過作用于大麻素受體CB1和CB2發(fā)揮生物活性。大量研究表明，內(nèi)源性大麻素具有神經(jīng)保護活性，因此內(nèi)源性大麻素作用的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)被認為是新型神經(jīng)保護藥物的靶點。近年來，內(nèi)源性大麻素的失活系統(tǒng)逐漸成為上述研究的新熱點。
　

2、　在前期工作中，我們合成了一系列結(jié)構(gòu)與AEA相似的脂氨基酸類化合物，研究中我們通過大鼠離體腦片的缺氧缺糖損傷和原代皮層神經(jīng)元的損傷實驗篩選出了具有良好的神經(jīng)保護作用的N-硬脂酰酪氨酸(N-stearoyltyrosine，NsTyr)。本研究以NsTyr為研究對象，采用SD大鼠原代神經(jīng)元Aβ?lián)p傷模型和OGD損傷模型探討其神經(jīng)保護活性以及其通過內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)介導(dǎo)的神經(jīng)保護的機制。
　　第一章 N-硬脂酰酪氨酸對抗Aβ?lián)p傷和OG

3、D損傷的神經(jīng)保護作用
　　β淀粉樣蛋白(Aβ)被認為是阿爾茨海默癥的主要致病原因，缺血再灌注是腦卒中損傷及其炎癥反應(yīng)和氧化損傷的主要原因。由于缺乏有效的防治方法和手段，使得阿爾茨海默癥和腦卒中影響著人們的生活質(zhì)量，并造成了社會經(jīng)濟負擔。
　　本研究采用了SD大鼠皮層神經(jīng)元建立Aβ?lián)p傷模型和OGD損傷模型，評價了NsTyr的抗Aβ毒性和抗OGD損傷神經(jīng)元的神經(jīng)保護作用。我們采用10μg/mL Aβ(1-40)片段建立Aβ?lián)p傷模

4、型;采用缺氧缺糖1h恢復(fù)培養(yǎng)24 h的處理流程建立OGD損傷模型。通過MTT檢測和LDH檢測，我們發(fā)現(xiàn)1-20μmol/L NsTyr對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的原代皮層神經(jīng)元具有保護作用，10μmol/L NsTyr對Aβ?lián)p傷和OGD損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護作用最強;結(jié)果還驗證了AEA直接給藥的局限性。Western Blot檢測表明NsTyr可以上調(diào)神經(jīng)元中大麻素受體CB1的表達，進一步提示了NsTyr的神經(jīng)保護作用與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)

5、有關(guān)。
　　第二章 N-硬臘酰酪氨酸通過抗凋亡途徑對抗Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護作用
　　內(nèi)源性大麻素的神經(jīng)保護作用及其本身作為神經(jīng)保護藥物局限性的報道促使人們把研究重點放在尋找內(nèi)源性大麻素介導(dǎo)的高效低毒神經(jīng)保護劑上。
　　本文研究通過Hoechst33342染色和TUNEL熒光染色發(fā)現(xiàn)Aβ和OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是通過凋亡途徑實現(xiàn)的，而NsTyr確能有效抑制這兩種損傷模型的神經(jīng)元凋亡。在損傷后和NsTyr處理后，

6、采用Western Blot檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，結(jié)果表明NsTyr可以下調(diào)損傷引起的Bax表達升高，并可上調(diào)損傷引起的Bcl-2表達降低。同樣觀察到NsTyr可以通過上調(diào)ERK的磷酸化達到抑制損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用。這些結(jié)果表明NsTyr通過抗凋亡途徑發(fā)揮對抗Aβ?lián)p傷和抗OGD損傷的神經(jīng)保護作用。通過MTT檢測、LDH檢測和Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)CB1阻斷劑AM251能逆轉(zhuǎn)NsTyr對Aβ?lián)p傷

7、和OGD損傷的保護作用，這進一步提示了NsTyr是通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用的。
　　我們前期研究中得到NsTyr與CB1沒有親和力的結(jié)果，提示NsTyr不是通過與CB1結(jié)合激動大麻素信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用的，本章證明NsTyr是通過抗凋亡途徑實現(xiàn)神經(jīng)保護作用的，這些結(jié)果凸顯了揭示NsTyr通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮抗凋亡的作用機制的理論和應(yīng)用價值。
　　第三章 N-硬脂酰酪氨酸通過介導(dǎo)內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)對抗Aβ

8、損傷和OGD損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用
　　脂氨基酸能抑制AEA水解酶FAAH活性的報道，促使我們研究NsTyr對FAAH的抑制作用。
　　為了明確NsTyr對FAAH的直接抑制作用，我們通過熒光底物檢測，證明NsTyr是通過抑制FAAH的活性(IC50=16.54 nmol/L)，發(fā)揮其對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護作用。Western Blot實驗結(jié)果表明NsTyr可以下調(diào)Aβ?lián)p傷和OGD損傷導(dǎo)致的FAAH表達的升高，提示

9、NsTyr具有蛋白水平對FAAH表達的抑制作用;而對FAAH mRNA的檢測表明，NsTyr也具有mRNA水平對FAAH表達的抑制作用。這些結(jié)果表明，NsTyr通過多種途徑抑制FAAH的活性，實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用。為了進一步明確NsTyr對FAAH的抑制作用，我們應(yīng)用了非選擇性FAAH抑制劑LY2183240和選擇性FAAH抑制劑URB597，對比評價分別應(yīng)用抑制劑及NsTyr對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護作用和對AEA失活途徑的抑制作

10、用。檢測細胞存活率、凋亡細胞計數(shù)、檢測Bcl-2、Bax及pERK蛋白表達的實驗結(jié)果都表明，與URB597不同，NsTyr和LY2183240都在抑制FAAH活性的同時，阻斷AMT的功能。由于LY2183240是AMT阻斷劑，我們進一步考察了NsTyr對AMT的直接作用。應(yīng)用3H放射性同位素檢測，發(fā)現(xiàn)NsTyr也能通過阻斷AEA膜轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運功能(IC50=11.74 nmol/L)發(fā)揮其對Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護作用。實驗結(jié)果表

11、明NsTyr可以下調(diào)由Aβ?lián)p傷和OGD損傷導(dǎo)致的AMT上游分子iNOS表達的升高和NO總量的增加。對iNOS的mRNA的檢測也進一步確認了這一結(jié)論。我們的實驗結(jié)果表明了NsTyr既是FAAH抑制劑也是AEA轉(zhuǎn)運體AMT的阻斷劑。
　　本研究首次明確了NsTyr抑制內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)發(fā)揮對抗Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護作用。這一結(jié)果進一步豐富了NsTyr的神經(jīng)保護作用的理論依據(jù)，也為了NsTyr作為內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)抑制劑的先