內(nèi)源性大麻素物質(zhì)anandamide對(duì)大鼠的心臟保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、內(nèi)源性大麻素物質(zhì)來(lái)源于細(xì)胞膜上的脂類前體物質(zhì),具有脂類物質(zhì)的特征,包括氨基化合物和長(zhǎng)鏈脂肪酸。Anandamide(N-花生四烯酸氨基乙醇,AEA)是一種內(nèi)源性大麻素物質(zhì),為花生四烯酸的衍生物。內(nèi)源性大麻素物質(zhì)可以參與機(jī)體內(nèi)許多生理和病理生理過(guò)程,如神經(jīng)行為、胃腸功能、應(yīng)激和焦慮、心血管功能。到目前為止根據(jù)藥理學(xué)效應(yīng)和基因序列,發(fā)現(xiàn)了兩種內(nèi)源性大麻素受體,1型受體(CB1)和2型受體(CB2)。這兩種受體廣泛分布于機(jī)體各種組織細(xì)胞,其中

2、包括心肌細(xì)胞。據(jù)報(bào)道內(nèi)源性大麻素物質(zhì)對(duì)心血管功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。如:內(nèi)源性大麻素物質(zhì)可以抑制自發(fā)性高血壓大鼠的心肌收縮力;內(nèi)源性大麻素物質(zhì)anandamide可以減輕由腎上腺素或缺血/再灌所導(dǎo)致的心律失常;anandamide可以減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷。然而,有關(guān)anandamide抗心律失常和抗缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未明嘹。
　　 本研究旨在應(yīng)用電生理學(xué)、功能學(xué)、免疫組化和流式細(xì)胞等方法探討內(nèi)源性大麻素物質(zhì)anan

3、damide的心臟保護(hù)作用及其作用機(jī)制。研究分為兩部分:(1)應(yīng)用冠脈結(jié)扎方法、細(xì)胞內(nèi)記錄方法、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),觀察anandamide對(duì)大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常的影響,并探討其電生理學(xué)機(jī)制。(2)應(yīng)用Langendorff灌注技術(shù),觀察心功能的變化;通過(guò)TUNEL,和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;利用激光共聚焦技術(shù),觀察心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度。觀察內(nèi)源性大麻素物質(zhì)anandamide對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷(I/R)的作用,并探

4、討其機(jī)制。
　　 Ⅰ內(nèi)源性大麻素物質(zhì)Anandamide抗大鼠心律失常的電生理學(xué)研究
　　 目的:Anandamide是一種內(nèi)源性大麻素物質(zhì),具有抗心肌缺血、抗心律失常等心臟保護(hù)作用,但其機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在探討Anandamide的抗心律失常作用及其電生理學(xué)機(jī)制。
　　 方法:利用大鼠冠脈結(jié)扎方法,觀察anandamide對(duì)在體心臟的抗心律失常作用;應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)記錄方法,觀察anandamide對(duì)離體心室

5、乳頭肌動(dòng)作電位的影響;利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),觀察anandamide對(duì)心室肌細(xì)胞L-型鈣電流以及各種鉀電流的影響,包括瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)、緩慢延遲整流鉀電流(Iss)、內(nèi)向整流鉀電流(IK1)和ATP敏感鉀電流(IKATP)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)Anandamide(1μM.kg-1)顯著抑制I/R誘發(fā)的心律失常。
　　 (2)Anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性的縮短乳頭肌動(dòng)作

6、電位復(fù)極化50％(APD50)和90％(APD90)時(shí)程;對(duì)部分去極化乳頭肌,Anandamide(100nM)不僅縮短APD50和APD90,同時(shí)降低動(dòng)作電位幅度、超射值和0期最大去極化速度。上述效應(yīng)可被內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(100 nM)所阻斷,而內(nèi)源性大麻素2型受體阻斷劑AM630(100 nM)對(duì)Anandamide的效應(yīng)無(wú)影響;L型鈣通道開放劑Bay K8644(0.5μM)、鉀通道阻斷劑氯化四乙銨(TEA,2

7、0mM)和NO合酶抑制劑L-NAME(1 mM)對(duì)Anandamide的效應(yīng)無(wú)影響。
　　 (3)Anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性降低心肌細(xì)胞L型鈣電流,使電流-電壓關(guān)系曲線上移。Anandamide(100 nM)不影響L型鈣通道的激活過(guò)程,但可以加速穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程,并且減慢通道失活后的復(fù)活。上述效應(yīng)可以被AM251(100 nM)所阻斷,而AM630(100 nM)對(duì)Anandamide的效應(yīng)無(wú)影響。<

8、br>　　 (4)Anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性地降低Ito、增加IKATP,而對(duì)Iss和IK1沒(méi)有影響。Anandamide使Ito的穩(wěn)態(tài)失活曲線左移,而使其失活后的復(fù)活曲線右移。內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM251和2型受體阻斷劑AM630都不能阻斷anandamide對(duì)Ito的抑制效應(yīng)。內(nèi)源性大麻素2型受體阻斷劑AM630可以阻斷anandamide增加IKATP的效應(yīng),而內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM

9、251沒(méi)有此阻斷效應(yīng)。
　　 小結(jié):Anandamide具有明顯的抗I/R心律失常作用。Anandamide的抗心律失常作用可能通過(guò)內(nèi)源性大麻素1型受體,導(dǎo)致心肌細(xì)胞L型鈣通道失活加速,失活后復(fù)活減慢,降低L型鈣電流,縮短動(dòng)作電位時(shí)程而實(shí)現(xiàn)。Anandamide亦可通過(guò)內(nèi)源性大麻素2型受體途徑增加IKATP;通過(guò)非受體途徑加速Ito通道失活,減慢失活后復(fù)活,從而抑制Ito。
　　 Ⅱ內(nèi)源性大麻素物質(zhì)anandamide對(duì)

10、大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及
　　 機(jī)制
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)旨在觀察內(nèi)源性大麻素物質(zhì)anandamide(AEA)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注(I-R)所致心功能損傷,梗死面積和凋亡的影響,并探討其機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用Langendorff灌注技術(shù),給予離體心臟30 min缺血/180 min再灌注處理,期間觀察左心室功能的變化;再灌注結(jié)束后,通過(guò)氯化三苯基四氮唑染色法測(cè)定心肌梗死面積;通過(guò)TUNEL和流式細(xì)胞技術(shù)

11、檢測(cè)細(xì)胞凋亡;利用激光共聚焦技術(shù)觀察心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度,[Ca2+]i用相對(duì)熒光強(qiáng)度((FI-FI0)/FI0,％)表示。
　　 結(jié)果:
　　 (1)應(yīng)用anandamide(1、10、100 nM)可濃度依賴性地促進(jìn)大鼠I-R后心功能的恢復(fù),減少梗死面積。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放劑蒼術(shù)苷(Atr,20/μM)、內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(1μM)、內(nèi)源性大麻素2型受體阻斷劑AM630(1μM)都可以完全阻斷

12、anandamide對(duì)I-R所致心功能損傷的保護(hù)作用。
　　 (2)應(yīng)用anandamide后TUNEL染色的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量以及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的心肌細(xì)胞凋亡率都明顯降低。與缺血再灌注組比較,應(yīng)用anandamide后心肌Bax蛋白表達(dá)明顯降低,而心肌Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax比率明顯升高。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放劑蒼術(shù)苷(Atr,20μM)、內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(1μM)、內(nèi)源性大麻素2型受體阻斷劑A

13、M630(1μM)都可以完全阻斷anandamide對(duì)I-R所致凋亡的減少作用。
　　 (3)在正常臺(tái)式液、無(wú)鈣臺(tái)式液以及模擬缺血液中,anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性地降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度。在正常臺(tái)式液中,內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(100 nM)可抑制anandamide(100nM)降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的效應(yīng),而內(nèi)源性大麻素2型受體阻斷劑AM630(100 nm)對(duì)anandamide(100

14、 nM)降低細(xì)胞內(nèi)鈣效應(yīng)無(wú)影響。在模擬缺血液中,AM630(100 nM)可抑制anandamide降低細(xì)胞內(nèi)鈣效應(yīng),而AM251(100 nM)對(duì)anandamide(100 nM)降低細(xì)胞內(nèi)鈣效應(yīng)無(wú)影響。在正常臺(tái)式液中,anandamide(100 nM)可抑制由L型Ca+通道激動(dòng)劑Bay K8644所致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高。在無(wú)鈣臺(tái)式液中,anandamide(100nM)可抑制由ryanodine所致的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高。