內(nèi)源性大麻素受體CB2介導(dǎo)抗心室重塑效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、慢性心力衰竭(CHF)簡(jiǎn)稱心衰，是各種心臟疾病的最終結(jié)局和主要死因，而冠心病尤其是心肌梗塞是造成心衰的主要病因，在心衰的病程中，很多因素參與了其發(fā)生發(fā)展，如rass激活，氧化應(yīng)激，心室重塑等，各種因素互為因果，病理生理機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，近年發(fā)現(xiàn)大麻素系統(tǒng)也參與了心衰的發(fā)病過(guò)程，大麻素包括外源性和內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(EC)，EC的配體主要有:內(nèi)源性花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯酸甘油（2-AG），EC的受體主要有:CB1及CB2。研究

2、顯示，終末期心衰AEA及2-AG水平均顯著升高;CB1略有下調(diào)而CB2顯著上調(diào)，但其在心衰中的作用及機(jī)制不明。
　　目前對(duì)心室重塑的評(píng)價(jià)尚缺乏理想的指標(biāo)，可通過(guò)基因水平檢測(cè)調(diào)亡基因或抗調(diào)亡基因的表達(dá)評(píng)估細(xì)胞層面的心肌重塑，通過(guò)檢測(cè)心肌膠原蛋白的含量評(píng)估基質(zhì)層面的心室重塑，脯氨酸是一種非必須氨基酸，在體內(nèi)絕大部分存在于膠原纖維中，且在不同型別膠原中占總蛋白量比例恒定，測(cè)定組織中羥脯氨酸含量可反映膠原纖維含量;檢測(cè)心肌組織Caspas

3、e-3，bcl-2，p65的表達(dá)。研究通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈，復(fù)制心肌梗塞心衰模型，研究心衰嚴(yán)重程度與EC的關(guān)系，及ec激活對(duì)心衰和心室重構(gòu)的影響。
　　第一章內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在不同程度心力衰竭大鼠中的變化
　　目的:
　　本章通過(guò)復(fù)制大鼠心衰模型，4周后觀察不同程度心力衰竭大鼠血清AEA、2-AG水平及心肌組織CB1與CB2表達(dá)與心功能及膠原生成的關(guān)系。
　　方法:
　　SPF級(jí)健康成年SD大鼠100只，通

4、過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，制作心肌梗死模型。冠脈結(jié)扎術(shù)后4周，再次以同樣方法麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺(tái)，M型超聲測(cè)定EF及左室內(nèi)徑。測(cè)定結(jié)束后，處死全部大鼠，腹主動(dòng)脈取血4～5毫升，-80℃二二二二保存，以備檢測(cè)?？焖偃〕鲂呐K，在液氮速凍后保存于-80℃冰箱，備用。測(cè)定BNP含量(ELISA);用超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒測(cè)定鼠血清SOD活性和MDA含量;AEA及2AG測(cè)定（高效液相色譜法）;心肌組織膠原含量檢測(cè)（氯胺T

5、法）;Masson膠原纖維染色;RT-PCR方法檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量;蛋白印跡法(WestemBlot)檢測(cè)心肌組織CB1和CB2蛋白表達(dá);應(yīng)用SPSS13.0軟件醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　制作心肌梗死模型術(shù)4周末存活55只，以BNP第一分位數(shù)(P25)及第三分位數(shù)(P75)將所有心力衰竭大鼠平均分為3組分別標(biāo)注為Group1;Group2;Group3，組間比較差異顯著。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻

6、素組分與心力衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)，隨心衰加重血清AEA、2-AG水平顯著升高;CB2顯著上調(diào);輕中度心衰CB1變化不明顯，重度心衰CB1顯著上調(diào)，說(shuō)明在心衰的自然病程中，CB1處于低表達(dá)狀態(tài)，而終末期心衰CB1顯著上調(diào)。提示主要是CB2而不是CB1介導(dǎo)了心衰的病理生理過(guò)程。隨心衰加重AEA、2-AG水平升高，心室膠原含量顯著升高，反映氧化應(yīng)激狀態(tài)及炎癥反應(yīng)指標(biāo)均呈明顯正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　內(nèi)源性大麻素水平與心功能相關(guān)，

7、隨著心衰加重，血清內(nèi)源性大麻素水平遞增，心肌膠原含量增多，同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素水平與氧化應(yīng)激相關(guān)，隨著內(nèi)源性大麻素水平的升高，氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛顯著升高，隨著心衰的加重，大麻素受體CB2表達(dá)的增加，丙二醛升高，呈正相關(guān)，而大麻素受體CB2的表達(dá)在輕中度心衰變化不明顯，嚴(yán)重心衰狀態(tài)下也顯著升高。表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與了心衰的發(fā)病過(guò)程，但無(wú)法確定這種變化在CHF中發(fā)揮的是有益抑或有害的作用，因此有必要進(jìn)一步探討CB2激活對(duì)心衰的作用及機(jī)制

8、。
　　第二章大麻素受體CB2激動(dòng)劑對(duì)心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:
　　本章通過(guò)復(fù)制大鼠心衰模型，并以CB2受體激動(dòng)劑JWH015激活CB2受體，或改變CB2受體的表達(dá)水平進(jìn)行干預(yù)，4周后觀察其對(duì)動(dòng)物心功能、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響
　　方法:
　　同時(shí)通過(guò)復(fù)制大鼠心力衰竭模型，基因克隆、腺病毒制備和注射;超聲下監(jiān)測(cè)大鼠心功能;以JHW015激活CB2受體，或于蛋白水平改變受體表達(dá)水平，

9、將AEA、2-AG水平，CB1及CB2表達(dá)量與MDA含量和SOD活性作一相關(guān)分析。觀察CB2受體激動(dòng)在心力衰竭中的作用，及其與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，AEA及2-AG水平與MDA呈正相關(guān)，與SOD活性呈負(fù)相關(guān);CB2亦顯示出類似改變。激動(dòng)CB2受體或過(guò)表達(dá)CB2受體均可緩解心力衰竭;同時(shí)減輕氧化應(yīng)激、抑制凋亡促進(jìn)蛋白Caspase3活性，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá);CB2

10、受體活化，可顯著抑制NK-κB中的活性成份，p65亞基。
　　結(jié)論:
　　1.內(nèi)源性大麻素組分與心力衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)，隨心衰的加重，血清AEA及2-AG水平顯著，心肌組織CB2表達(dá)顯著上調(diào)，而CB1表達(dá)在輕中度心衰中變化不明顯，重度心衰中也顯著升高，說(shuō)明在心衰的自然病程中，CB1可能處于低激活狀態(tài);
　　2.隨著AEA、2-AG水平的升高和CB2表達(dá)的上調(diào)，心肌膠原含量增加。
　　3.CB2受體上調(diào)可改善心功能

11、及抑制心室重塑，對(duì)心力衰竭有益，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激，減少凋亡相關(guān)蛋白活化及抑制NF-κB的活性及表達(dá)有關(guān)。
　　第三章心肌細(xì)胞CB2受體激動(dòng)抑制NF-κB活性并減輕氧化應(yīng)激損傷
　　目的:
　　研究CB2受體與及NF-κB信號(hào)通路主要執(zhí)行者p65表達(dá)及活性的關(guān)系，進(jìn)一步探討CB2受體激動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　在前述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用消化酶消化法分離培養(yǎng)乳鼠

12、心肌細(xì)胞，以免疫熒光染色法進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定，蛋白印跡檢測(cè)CB2受體激動(dòng)后p65的表達(dá)情況，同時(shí)通過(guò)在心肌細(xì)胞中改變其不同CB2功能狀態(tài)（下調(diào)、激活或抑制），電泳遷移率變化試驗(yàn)(EMSA)法，檢測(cè)CB2受體激動(dòng)后核蛋白NF-κB在細(xì)胞內(nèi)的分布情況及功能狀態(tài)。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad-Prism進(jìn)行。正態(tài)分布計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;多組間比較采用方差分析，以SNK法校正兩兩比較;兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)t-檢驗(yàn)完成。
　　

13、結(jié)果:
　　蛋白印跡結(jié)果顯示CB2受體激動(dòng)后可抑制p65表達(dá)。同時(shí)，EMSA結(jié)果顯示，CB2受體激動(dòng)后核蛋白與NF-κB探針序列結(jié)合能力增強(qiáng)，突變探針?lè)磻?yīng)證實(shí)了結(jié)合序列的特異性;Super-Shift反應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)核蛋白中與靶序列結(jié)合的為NF-κB。下調(diào)或抑制CB2導(dǎo)致NF-κB出現(xiàn)相反結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)CB2受體激動(dòng)具有抑制NF-κB的作用。
　　結(jié)論:
　　CB2受體激動(dòng)可直接顯著地抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活，并抑制