2014-2015年河南省PRRSV的分子檢測、變異分析及HP-PRRSV分離株全基因組序列分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種以妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病為特征的高度接觸性傳染病，新生仔豬死亡率較高，并可引起免疫抑制及持續(xù)性感染。自我國首次報道PRRS至今，該病已歷經(jīng)20年的

2、流行及演變，特別是2006年我國暴發(fā)高致病性PRRS（HP-PRRS），給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。2008年，美國分離到PRRSV變異株NADC30，與北美經(jīng)典毒株VR2332相比，其Nsp2蛋白存在131個氨基酸的不連續(xù)缺失。2012年以來，具有相同缺失特征的類NADC30毒株已在我國13個省市相繼出現(xiàn)，且與國內(nèi)PRRSV流行毒株發(fā)生重組。PRRSV具有高度變異的特點，導致毒株多樣性顯著，不同毒株在抗原性及致病性等方面存在一定差異，

3、這也正是PRRS難以防控和消除的重要原因之一。
　　本研究旨在通過對河南省PRRSV流行毒株進行分子檢測及NSP2、ORF5基因的變異分析，并對流行毒株進行分離鑒定及全基因序列測定與分析，了解其部分生物學特性、分子變異特征和遺傳進化情況，揭示河南地區(qū)PRRSV最新流行動態(tài)及變異趨勢，以期為PRRS臨床診斷、疫情預警、新型疫苗及抗病毒藥物的研發(fā)提供科學的參考依據(jù)。
　　1.2014-2015年河南省PRRSV的分子檢測及NSP

4、2、ORF5基因變異分析
　　為了解河南省PRRSV流行毒株的分子特征及變異情況，本試驗對2014-2015年采自河南各地165個養(yǎng)殖場的414份疑似PRRS的臨床樣品進行RT-PCR檢測，并對PRRSV陽性樣品的NSP2和ORF5基因進行測序及比對分析。結(jié)果顯示，共檢出PRRSV陽性樣品123份，陽性率為29.7％；擴增得到50個NSP2和64個ORF5基因序列；遺傳進化分析表明，河南地區(qū)PRRSV流行毒株主要為美洲型毒株，其中

5、40株與美洲毒株NADC30高度同源，且該類毒株NSP2蛋白存在131個氨基酸的不連續(xù)缺失，與國內(nèi)外已有報道一致；其余21株與我國HP-PRRSV代表性毒株JXA1高度同源。與2012-2013年相比，2014-2015年河南地區(qū)PRRSV流行毒株以類NADC30毒株為優(yōu)勢毒株，其在流行毒株中所占比例急劇上升；大多數(shù)HP-PRRSV毒株與疫苗株JXA1-P80親緣關系較近，且PRRSV流行毒株的NSP2和ORF5基因均發(fā)生較大變異，提示

6、弱毒疫苗的廣泛使用及引種數(shù)量劇增可能是造成PRRSV優(yōu)勢流行毒株在河南地區(qū)發(fā)生改變并迅速擴散的重要原因之一。因此有必要對PRRSV的流行和變異進行持續(xù)監(jiān)測，并對其致病性等方面進行深入研究，以期為臨床診斷和疫病防控提供科學的參考依據(jù)。
　　2.4株HP-PRRSV毒株的分離與鑒定
　　將檢測結(jié)果為PRRSV陽性的組織樣品接種Marc-145細胞，通過連續(xù)傳代進行病毒分離，并利用RT-PCR及間接免疫熒光試驗（IFA）對分離毒株

7、進行鑒定。結(jié)果顯示，從52份陽性樣品中成功分離到4株HP-PRRSV，分別命名為HENZK-1、HENPDS-2、HENZMD-5和HENXC-1，其第5代細胞培養(yǎng)物的病毒含量分別為105.77TCID50/mL、106.75TCID50/mL、104.80TCID50/mL和104.36TCID50/mL。本試驗為研究PRRSV流行毒株的致病性及遺傳進化等方面奠定了基礎。
　　3.HP-PRRSV毒株HENZK-1和HENPDS

8、-2全基因組序列的測定與分析
　　利用RT-PCR方法對分離株HENZK-1和HENPDS-2株全基因組進行擴增、測序與分析。結(jié)果顯示，HENZK-1和HENPDS-2株全基因組長度分別為15019bp和15020bp，不含Poly(A)尾。序列比對分析顯示，2個分離株Nsp2蛋白均存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失，具有HP-PRRSV毒株的遺傳特征，同時還存在新的變異。核苷酸序列的同源性及遺傳進化分析表明，2個分離株與HP-PRRS

9、V代表性毒株JXA1各代次致弱毒株（JXA1-P10~P170）及其3個疫苗返強毒株NT1、NT2和NT3的同源性分別為99.3%~99.4%和99.6%~99.8%，屬于以JXA1為代表的亞群，且分布于同一個進化分支，與JXA1-P45和NT2親緣關系較近，提示HENZK-1和HENPDS-2可能為疫苗返強毒株，回歸動物試驗初步結(jié)果表明它們具有明顯的致病性。本試驗為深入研究HP-PRRSV毒株的遺傳演變規(guī)律及毒力等奠定了基礎，同時也為

10、疫病防控和疫苗研發(fā)及使用提供了科學的參考依據(jù)。
　　4.PRRSV類NADC30毒株HENXX-1全基因組序列的測定與分析
　　利用RT-PCR方法對河南流行株HENXX-1株全基因組進行擴增、測序與分析。結(jié)果顯示，HENXX-1株全基因組長度為15019bp，不含Poly(A)尾。核苷酸序列的同源性分析顯示，其與NADC30的同源性為96.0%，與VR-2332、CH-1a和JXA1的同源性分別為85.3%、84.6%和8