河南省2008年手足口病病原體(EV71)分離株全基因組序列.pdf

1、了解滴南省2008年手足口病病原體流行特征，獲得一株EV71分離株的全基因組核苷酸序列并對(duì)其進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，獲得該EV71毒株的基因型。
　　 材料與方法
　　 收集2008年河南省18個(gè)地市在門(mén)診就診和住院的手足口臨床診斷病例的血清和/或糞便(咽拭子、皰疹液、腦脊液)標(biāo)本，運(yùn)用國(guó)家CDC推薦的分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定；同時(shí)選取部分標(biāo)本接種人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞)進(jìn)行病毒分離。提取其中一株EV71分

2、離毒株的RNA，設(shè)計(jì)八對(duì)引物，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription PCR即RT-PCR)擴(kuò)增其全基因組序列，產(chǎn)物純化后另外設(shè)計(jì)八對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序；用Clustal(1.8)X、GeneDoc、DNAStar、MEGA3等軟件進(jìn)行核苷酸整理、拼接組裝、校對(duì)、同源性比較、氨基酸序列分析、基因進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等分子變異研究；與GenBank中EV71毒株的各基因亞型代表株的VP1段進(jìn)行同源性分析并對(duì)該株毒株定型

3、。
　　 結(jié)果：
　　 1樣本檢測(cè)結(jié)果
　　 共檢測(cè)435份手足口病臨床診斷病例的不同標(biāo)本，EV71檢出率為16.78％，Cox.A16檢出率為1.38％，經(jīng)檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。檢出陽(yáng)性病例中，男、女性別比為2.3:1(54/23)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)69份標(biāo)本進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)和病毒分離，7份標(biāo)本出現(xiàn)明顯致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，其中EV71占85.7％(6/7)，Cox.A16占14.3％

4、(1/7)。對(duì)分離株再次用RT-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率達(dá)100％。
　　 2一株EV71分離株的全基因組序列分析
　　 EV71 HENAN08分離株全基因組序列長(zhǎng)度為7405bp(未包括多聚腺苷酸尾)，其中腺嘌呤核苷酸(A)占27.01％，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(G)占24.00％，胸腺嘧啶核苷酸(T)占24.92％，胞嘧啶核苷酸(C)占24.07％。A和T豐富。從基因組的5'術(shù)端開(kāi)始有742個(gè)堿基的5'非編碼區(qū)(5'UTR)，與S

5、HZH98株、BrCr株、Zhejiang08株和TW2086株(743個(gè)堿基)不同。5'UTR之后為6579bp的編碼區(qū)，編碼含2193個(gè)氨基酸的多聚蛋白，其后為84個(gè)堿基的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。與其它EV71毒株相比，HENAN08株在編碼區(qū)沒(méi)有核苷酸的缺失和插入，但在5'UTR和3'UTR區(qū)存在個(gè)別核苷酸的缺失和插入。
　　 核苷酸同源性比較：在整個(gè)基因組，包括5'UTR區(qū)、編碼區(qū)(P1、P2和P3)和3'UTR區(qū)，

6、和AnhuiFY08株以及Zhejiang08株的同源性均高于95％；在P1區(qū)，HENAN08與AnhuiFY08、SHZH98、Zhejiang08、SHZH03株的同源性均>90％，與BrCr和TW2086的同源性均>80％，而與Cox.A16的同源性最低，<70％；在3'UTR區(qū)，與標(biāo)準(zhǔn)株BrCr以及TW2086的同源性最低。
　　 氨基酸同源性比較：在整個(gè)編碼區(qū)，EV71 HENAN08株與其它國(guó)內(nèi)、外EV71株的同源性

7、均較高，與Cox.A16同源性較低；在P2和P3區(qū)，HENAN08與其它國(guó)內(nèi)EV71株的同源性均較高，而與標(biāo)準(zhǔn)株BrCr以及TW2086的同源性低于Cox.A16：結(jié)構(gòu)蛋白VP1區(qū)，EV71 HENAN08株與AnhuiFY08、SHZH98、標(biāo)準(zhǔn)株BrCr、Zhejiang08、SHZH03、TW2086株的同源性均>95％，與Cox.A16的同源性最低，為72.7％。結(jié)構(gòu)蛋白VP4區(qū)的同源性比較都為100％。
　　 結(jié)論：<